BAB IV ASIL DAN PEMBAASAN 4.1. Skrining Alkaloid dari Tumbuhan Alstonia scholaris Serbuk daun (10 g) diekstraksi dengan amonia pekat selama 2 jam pada suhu kamar kemudian dipartisi dengan diklorometan. Ekstrak diklorometan selanjutnya ditambahkan Cl 5 % sehingga terbentuk dua lapisan yaitu fraksi diklorometan dan fraksi asam. Terhadap fraksi asam ditambahkan dua tetes pereaksi Meyer dan terbentuk endapan putih yang menunjukkan ekstrak tersebut mengandung senyawa alkaloid. Perlakuan yang sama terhadap fraksi asam ditambahkan pereaksi Dragendorf ditandai dengan terbentuknya endapan coklat kemerahan.. 4.2. Ekstraksi Senyawa Alkaloid Serbuk daun A.scholaris sebanyak 1,1 kg diekstraksi dengan amonia pekat selama dua jam kemudian dipartisi dengan diklorometan pada suhu kamar. Ekstrak diklorometan disaring, kemudian filtrat diuapkan pelarutnya menggunakan rotavapor vacum sehingga diperoleh ekstrak diklorometan sebanyak 310 g. Ekstrak diklorometan diasamkan dengan larutan Cl 5% (p 3-4) sehingga diperoleh dua lapisan, lapisan atas (air) dan lapisan bawah (diklorometan). Fraksi air diulangi, diekstraksi dengan diklorometan sampai senyawa non alkaloid terekstraksi semuanya. 42
43 Selanjutnya terhadap fasa air ditambahkan amonia pekat (p 9-10) dan fraksi tersebut dipartisi dengan diklorometan yang mengandung alkaloid total sebanyak 13 gram. 4.3 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Alkaloid Ekstrak alkaloid sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom, terlebih dahulu dilakukan pemilihan berbagai perbandingan eluen pada kromatografi lapis tipis (KLT) dan menghasilkan eluen eluen terbaik, yaitu campuran diklorometan-metanol 9:1. Komposisi campuran diklorometan-metanol tersebut digunakan untuk proses pemisahan selanjutnya, yakni kromatografi kolom grafitasi. Monitoring adanya spot senyawa alkaloid pada analisis KLT ditentukan dengan lampu UV dan pereaksi Dragendorf. asil monitoring tersebut menghasilkan adanya alkaloid yang memberikan perpendaran berwarna biru di bawah lampu UV dan memberikan spot coklat kemerahan pada pereaksi Dragendorf. Ekstrak alkaloid sebanyak 13 g selanjutnya dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom grafitasi dengan eluen diklorometan, dan campuran diklorometan-metanol yang kepolaranya ditingkatkan secara gradien menghasilkan tiga fraksi utama, yakni fraksi A (0,1676 g), fraksi B (0,1764 g), dan fraksi C (0,1398 g) seperti tercantum pada Gambar-4.1. Fraksi B (0,1764 g) selanjutnya dilakukan pemisahan dengan metode yang sama seperti di atas dan kondisi eluen yang sama menghasilkan senyawa alkaloid yang berwujud serbuk berwarna kuning, selanjutnya dilakukan uji kemurnian dengan
44 berbagai eluen seperti terlihat pada Gambar-4.2. Senyawa alkaloid hasil isolasi tersebut diidentifikasi berdasarkan analisis spektroskopi. Gambar-4.1. Analisis KLT hasil kromatografi kolom grafitasi Alkaloid murni Padatan kuning Alkaloid murni yang diuji spektroskopi Alkaloid murni Padatan kuning Kloroform: methanol diklorometana: methanol Aseton: n-heksana 9,5 : 0,5 9,5 : 0,5 8 : 2 Gambar-4.2. Uji kemurnian senyawa alkaloid dengan analisis KLT
45 4.3.1 Identifikasi Titik Leleh Senyawa murni Penentuan titik leleh senyawa murni merupakan salah satu penentuan sifat fisik dari suatu senyawa murni. Berdasarkan penentuan titik leleh untuk senyawa murni fraksi B, diperoleh serbuk berwarna kuning kecoklatan dengan titik leleh 159-160 o C. 4.4 Analisis Spektroskopi 4.4.1 Analisis spektroskopi ultraviolet senyawa hasil isolasi Spektroskopi ultraviolet merupakan satu metode spektroskopi yang memberikan informasi mengenai ikatan rangkap terkonjugasi dan adanya suatu gugus aromatik. Berdasarkan hasil analisis spektroskopi UV-Vis, senyawa alkaloid hasil isolasi dalam pelarut diklorometan memberikan puncak serapan maksimum λ maks 230 nm. Puncak serapan memberikan indikasi bahwa senyawa hasil isolasi merupakan kromofor alkaloid indol, yakni transisi π ke π *. Gugus kromofor indol pada alkaloid indol terletak pada panjang gelombang maksimum 228-230 nm (Feng, et al., 2009) 4.4.2 Analisis spektroskopi inframerah senyawa hasil isolasi Analisis spektroskopi inframerah bertujuan untuk menentukan gugus fungsi pada senyawa alkaloid hasil isolasi yang memberikan pita serapan pada rentang bilangan gelombang 4000 cm -1 450 cm -1. asil dari spektrum inframerah meberikan indikasi adanya gugus N amina pada bilangan gelombang 3459,36 cm -1, gugus O dengan bilangan gelombang 3626,46 cm -1, C=O karbonil pada bilangan gelombang
46 1644,61 cm -1, C=C aromatik pada bilangan gelombang 1633,60 cm -1, dan gugus C-O eter pada bilangan gelombang 1219,65 cm -1. 4.4.3 Analisis spektroskopi NMR senyawa hasil isolasi Analisis spektroskopi 1 -NMR senyawa alkaloid hasil isolasi dengan pelarut CDCl 3 memperlihatkan adanya empat proton aromatik yang saling terkopling satu sama lain, yakni kopling orto, kopling meta, dan kopling para yang sangat kecil pada δ 7,54 (dd, J = 2,4z, 3,6z; 6z; 9z; -9); 7,13 (m, J = 2,4 z; 6z, 9z; - 10) 6,77 (t, J = 3,6z, 9z; -11);, dan 7,71 ppm (dd, J = 2,4z, 3,6z; 6z, 9z ;-12) yang mengindikasikan bahwa senyawa alkaloid hasil isolasi tersebut merupakan alkaloid indol yang tidak mempunyai substituen pada cincin aromatik (Rahman, 1986). Pada spektrum 1-NMR seperti terlihat pada Tabel-4.1 memperlihatkan pergeseran kimia pada δ 7,71 ppm (-9) dan δ 7,13 ppm (-10) menunjukkan dua proton aromatik yang terletak pada posisi orto (J= 6-9z), pergeseran kimia δ 7,71 ppm (-9, J= 3,6z) dan δ 7,54 ppm (-11, J= 3,6z) menunjukkan dua proton aromatik yang terletak pada posisi meta, pergeseran kimia δ 7,13 ppm (-10, J= 9z) dan δ 7,54 ppm (-11, J=6-9z) yang menunjukkan dua proton aromatik yang terletak pada posisi orto, dan pergeseran kimia. δ 7,13 ppm (-10, J= 2,4 z) dan δ 6,77 ppm (-12, J= 3,6) yang menunjukkan dua proton aromatik yang terletak pada posisi meta.
47 a b c N d Gambar 4.3. Kerangka indol Adanya gugus metin yang terkonyugasi pada pergeseran kimia δ 5,82 ppm (-19) dan δ 7,44 ppm (-21) merupakan ciri khas alkaloid indol dari turunan aspidodasikarpin. Tiga sinyal singlet pada δ 3,61, 3,97 dan 1,90 ppm merupakan sinyal metil dari gugus ester, sinyal metoksi, dan sinyal metil yang merupakan sinyal dari monoterpen sekologanin. Sinyal metin dan metilen senyawa alkaloid hasil isolasi dapat dilihat Tabel-4.1. Analisis spektrum 13 C-NMR (Percobaan Apt) memperlihatkan senyawa alkaloid mempunyai 23 atom karbon, dimana sinyal yang sefasa dengan pelarut CDCl 3 merupakan sinyal metilen, dan C kuartener sedangkan yang berlawanan fasa merupakan metil dan metin. Adanya sinyal karbon metin dari kerangka indol terlihat pada pergeseran karbon δc 127,2 (C-9), 127,7 (C-10), 128,1 (C-11), dan 119,4 ppm (C-12). Sementara atom C kuartener kerangka monoterpen indol tersebut terlihat pada 196,9 (C-2), 139,4 (C-8), dan 143,9 ppm (C-13). Atom C kuartener karbonil dari gugus ester terlihat pada δc 171,9 ppm. Dua gugus metilen (C 2 ) sp 3 yang terletak pada pergeseran kimia δc 38,7 ppm (C-6) dan 29,5 ppm (C-14). Adanya gugus metil (C 3 ) terlihat pada pergeseran kimianya sebesar δc 11,0 ppm (C-18).
48 Tabel 4.1 Data spektrum 1 -NMR dan 13 C-NMR Alkaloid indol senyawa B dengan senyawa narelin Posisi 1 -NMR senyawa B 1 -NMR senyawa narelin Posisi 13 C-NMR senyawa B 13 C-NMR senyawa narelin a( -9) 7,71; dd 7,77; d Ca(C-9) 127,2 125,0 b(-10) 7,13; m 7,29; t Cb(C-10) 127,7 125,6 c(-11) 7,54; dd 7,45; t Cc(C-11) 128,0 128,5 d(-12) 6,77; t 7,66; d Cd(C-12) 119,4 119,8 Tabel 4.2 Data spektrum 1 -NMR monoterpen indol senyawa B dengan senyawa alschomine Posisi 1 -NMR senyawa B 1 -NMR senyawa alschomine Posisi 1 -NMR senyawa B 1-NMR senyawa alschomine -2 - - -16 2,62; s 2,66; d -3 4,23; m 4,28; t -17 - - -5 5,01; dd 5,01; d -18 1,90; s 1,80; d -6 3,73; m 2,72; d -19 5,82; m 6,12; q -7 - - -20 - - -8 - - -21 7,44; s 7,49; s -13 - - COOMe 3,74; s 3,74-14 2,36; t 2,30; dt OMe 3,90 3,40-15 3,5; s 3,34; brs - - -
49 Berdasarkan hasil pengukuran 1 dan 13 C-NMR senyawa alkaloid hasil isolasi merupakan alkaloid dari jenis kerangka aspidodasikarpin yang mana alkaloid indol pada senyawa B memiliki kemiripan dengan senyawa narelin dan kerangka monoterpen indol senyawa B yang memiliki kemiripan dengan senyawa alschomin sehingga struktur senyawa B dimungkinkan memiliki kerangka seperti pada Gambar- 4.3 akan tetapi untuk memastikan struktur molekul senyawa tersebut MASI diperlukan pengukuran spektrum massa serta spektrum korelasi 2D MQC, dan MBC. 17 10 11 9 12 13 8 1 N CO 2 C 3 16 6 5 O O OC 2 3 N 4 21 3 20 14 15 19 18 Gambar 4.4 Kerangka molekul senyawa fraksi B 4.5 asil Uji Aktivitas Antiplasmodial Uji aktivitas antimalaria secara in vitro dengan menggunakan metode Candle jar, Plasmodium falciparum dibiakkan dalam media RPMI 1640, EPES, larutan natrium bikarbonat, dan serum manusia, di inkubasi dalam eksikator yang berisi lilin (candle jar) atau dalam inkubator dengan CO 2 5% pada suhu 37 0 C.
50 Dalam uji aktivitas antimalaria diperlukan parasit dengan stadium yang sama yaitu pada stadium cincin yang dalam biakannya akan berkembang menjadi skizon, sehingga diperlukan proses sinkronisasi dalam larutan 5% sorbitol untuk membunuh parasit yang berumur lebih dari 18 jam. Satu siklus aseksual (skizogoni) Plasmodium falciparum berlangsung selama 48 jam. Setelah diinkubasi selama 48 jam, dibuat hapusan darah tipis dan diwarnai dengan giemsa. apusan tersebut diamati dengan mikroskop dengan pembesaran 1000 kali dan dihitung jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit malaria tiap 5000 eritrosit. Pada inkubasi 48 jam, biakan isolat Plasmodium falciparum yang semula berbentuk cincin akan tumbuh membentuk skizon. Uji aktivitas antimalaria dari ekstrak alkaloid terhadap P. falciparum dikategorikan kuat apabila IC 50 yang dihasilkan sebesar 2,00 μg/ml dan ekstrak dikatakan aktif jika nilai IC 50 <50 μg/ml (Kohler, et al,. 2002). Kontrol positif yang digunakan adalah kloroquin difosfat dengan nilai IC 50 sebesar 1,03 μg/ml. ubungan antara Dosis Pemberian Ekstrak Alkaloid Alstonia scholaris vs % penghambatan P. falciparum dapat dilihat pada Gambar-4.5.
51 80 70 60 Replikasi 1 Replikasi 2 Rata-rata penghambatan % Penghambatan Parasit 50 40 30 20 0.01 0.1 1 10 Dosis Ekstrak Alkaloid Daun Alstonia scholaris Gambar 4.5 Grafik ubungan Antara Dosis Ekstrak Alkaloid Daun Alstonia scholaris dengan Prosentase Penghambatan P.falciparum. Dari grafik 4.5 dapat terlihat untuk replikasi 1 maupun replikasi 2 yang mengindikasikan bahwa semakin bertambahnya kadar larutan bahan uji yang diberikan terhadap parasit maka bertambah pula prosentase penghambatannya dan semakin kuat bahan uji dalam menekan laju pertumbuhan parasit. Pada pembanding (kloroquin difosfat), pertumbuhan cincin dan skizon pada inkubasi 48 jam terlihat adanya penurunan bahkan ada bentukan cincin dan skizon yang terhambat/mati, hal ini terlihat dengan jumlah parasit yang sangat sedikit pada eritrosit. Perhitungan aktivitas antimalaria digunakannya analisis probit untuk mengetahui nilai IC 50 dari sampel uji. Nilai IC 50 ini menunjukkan besarnya sampel uji yang dapat menghambat 50% pertumbuhan parasit. Sampel uji yang digunakan adalah ekstrak alkaloid total daun A.scholaris bukan senyawa murni hasil isolasi. al
52 ini dikarenakan jumlah senyawa murni yang tidak mencukupi setelah penggunaannya dalam analisis spektroskopi. Dari perhitungan hasil uji antimalaria, diperoleh rata-rata nilai IC 50 sebesar 1,926 μg/ml. Ekstrak suatu senyawa dari tumbuhan memiliki keaktifan sebagai antimalaria apabila memiliki nilai IC 50 kurang dari 50 μg/ml (Kohler, et al,. 2002) atau kurang dari 5μg/ml (Fidock dan David, 2004). Sedangkan untuk pembandingnya yaitu kloroquin difosfat, memiliki nilai IC 50 sebesar 1,03 μg/ml. al ini menunjukkan bahwa kloroquin difosfat lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan parasit malaria dibanding dengan ekstrak alkaloid daun A.scholaris. Ekstrak alkaloid daun A.scholaris kurang efektif dibandingkan dengan kloroquin difosfat, namun dengan nilai IC 50 yang kurang dari 50 μg/ml memiliki potensi yang besar sebagai alternatif antiplasmodial dalam menghambat pertumbuhan Plasmodium falciparum. Semakin kecil nilai IC 50 yang diperoleh dalam analisis perhitungan aktivitas malaria, semakin toksik suatu bahan dalam menghambat pertumbuhan parasit.