PAkTI ITS PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIMALARIA DAN INSEKTISIDA FRAKSI ETIL ASETAT DAN SENYAWA 5,7,2',5",7",4"-HEKSAHIDROKSIFLAVANON-[3,8"]- FLAVON DARI BATANG Garcinia celebica Linn Disusun oleh : Mirna Saga Febryna Sara (1407100050) Dosen Pembimbing : Prof. Dr. Taslim Ersam Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam ITS Surabaya 2011
Latar Belakang Kumarin Flavonoid Santon Biflavonoid Perangkat Biokimia Farmakologi Fisiologi Garcinia
Latar Belakang Aktivitas Antimalaria Kina : Pemanfaatan Tumbuhan memiliki efek samping terhadap Berkhasiat kesehatan manusia, seperti sakit kepala dan gangguan Lebih Baik Pencegahan fungsi mata Alternatif Obat Antimalaria Daripada Pengobatan Obat Sintetik (Kloroquin) : Aman mengalami kendala setelah Efektif ditemukan beberapa kasus resistensi terhadap P. Garcinia falciparum Alternatif Insektisida Alami 5,7,2',5",7",4"-heksahidroksiflavanon-[3,8"]-flavon (1) dan fraksi etil asetat
Permasalahan HO HO O OH OH O (1) HO O?? OH O FRAKSI ETIL ASETAT Apakah aktif sebagai Antimalaria dan Insektisida
Tujuan dan Manfaat Tujuan Penelitian Mengetahui potensi senyawa biflavon (1) dan fraksi etil asetat sebagai antimalaria dan insektisida Manfaat Penelitian Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan nilai manfaat pada senyawa hasil isolasi, memperoleh bahan antimalaria baru yang efektif dan aman. Serta dapat memberi informasi insektisida baru yang diharapkan nantinya dapat menghambat penyebaran penyakit malaria
Malaria dan Mekanisme Kerja Obat Antimalaria Sitoplasma parasit Sitoplasma eritrosit Heme Sistein protease globin Hemozooin peptida Vakuola makanan Sistein protease Asam amino N N Fe heme O O O O N N Proses metabolisme hemoglobin di dalam vakuola makanan parasit Heme bebas (Fe 3+ ) bersifat sangat beracun karena dapat menyebabkan spesi oksigen yang sangat reaktif sehingga dapat merangsang atau memicu reaksi oksidatif sehingga parasit menjadi mati. hemozoin
Material dan Metode ALAT tabung eppendolf, laminer air flow, lemari pendingin, candle jar, sentrifuge, tabung sentrifuge, botol scot, labu erlenmeyer steril, kertas saring berukuran pori 0,22 μm, kaca preparat, inkubator CO 2, pipet pasteur, mikropipet, pipet volume, cawan petri, termometer, plat well 24, mikroskop dan tabung reaksi. BAHAN senyawa 5,7,2',5",7",4"-heksahidroksiflavanon-[3,8"]-flavon (1) dan fraksi etil asetat dari batang Garcinia celebica Linn (Discostigma Fabriel Miq). P. falciparum (Strain 3D7), HEPES, RPMI 1640 (Rosewell Parla Memorial Institute), Natrium bikarbonat (NaHCO 3 ), hiposantin, gentamisin, aquademineralisasi (aqua DM), serum darah manusia (PMI, Surabaya), natrium klorida (NaCl), dimetilsulfoksida (DMSO), minyak immerse, dan pewarna Giemsa 20%, larva nyamuk Aedes aegypty instar III.
Material dan Metode 1. UJI AKTIVITAS ANTIMALARIA Persiapan Medium Prosedur Kultur Biakan Pemanenan dan Penghitungan Analisa Data Aktivitas Antimalaria 2. UJI INSEKTISIDA Persiapan Larutan Uji Pengujian Insektisida Dengan Larva Nyamuk Aedes Aegypti Analisa Data
Persiapan Medium 1. UJI AKTIVITAS ANTIMALARIA natrium bikarbonat hipoxantin Air steril HEPES gentamysin Pembuatan Medium Tak Lengkap Pembuatan Medium Lengkap RPMI1640 Inkubator Larutan filtrat *diinkubasi pada suhu 37 C Medium Serum lengkap Medium tak lengkap
Prosedur Kultur Biakan NaCl 3,5% Medium tidak lengkap Medium lengkap Eritrosit 50% Parasit Beku disentrifuge Supernatan Diulangi Disentrifuge tiga diambil kali Endapan Inkubasi parasit okontrol negatif : o Senyawa 1 dengan konsentrasi 0,001;0,01;0,1;1dan 10 g/ml o Fraksi etil asetat dengan konsentrasi 0,01;0,1;1;10 dan 100 g/ml odiinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam
Prosedur Pemanenan Parasit Dibuat hapusan tipis di atas kaca preparat Difiksasi dengan metanol Diwarnai dengan Gimsea 20% Minyak immersi
Analisa Data Aktivitas Antimalaria Persentase parasetemia % Parasitemia = eritrosit yang terinfeksi 1000 eritrosit X 100% Persentase penghambatan % Penghambatan= 100% -Xp/Xk X 100% Dimana : Xp = parasitemia uji Xk = parasitemia control negatif Analisa data hasil uji antimalaria seluruhnya dari tiap-tiap perlakuan diolah menggunakan analisa probit program SPSS seri 16,0 untuk menentukan IC 50
Persiapan Larutan Uji 2. UJI INSEKTISIDA Senyawa Uji Dilarutkan dengan DMSO 0,5 % Diencerkan Dengan Aquades Untuk fraksi : 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 μg/ml Untuk kontrol negatif: DMSO 0,5 % +aquades Untuk senyawa murni: 400, 40, 4, 0,4 μg/ml
Uji Insektisida Ditambahkan 10 ekor larva nyamuk Aedes Aegypti instar III Dihitung % kematiannya
Analisa Data Aktivitas Insektisida Setelah pemaparan selama 24 jam, maka dapat dianalisa: Rata-Rata Hidup dan Mati Mati dan Hidup Akumulasi % Mortalitas Grafik antara log konsentrasi dengan % mortalitas Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC 50 < 500 μg/ml untuk ektrak dan < 50 μg/ml untuk suatu senyawa (Meyer dkk, 1982)
Uji Aktivitas Malaria Dosis Uji (μg/ml) R % Parasitemia % Pertumbuhan % Hambatan % Hambatan 0 jam 48 jam rata-rata Kontrol (-) 1 1,37 4,32 2,95 - - 2 1,37 4,34 2,97-10 1 1,37 2,13 0,76 74,24 72,64 2 1,37 2,23 0,86 71,04 1 1 1,37 2,85 1,48 49,83 51,18 2 1,37 2,78 1,41 52,52 0,1 1 1,37 3,23 1,86 36,95 36,15 2 1,37 3,29 1,92 35,35 0,01 1 1,37 3,44 2,07 29,83 29,39 2 1,37 3,48 2,11 28,96 0,001 1 1,37 3,85 2,48 15,93 16,72 2 1,37 3,82 2,45 17,51 penghambatan pertumbuhan parasit 50%
Uji Aktivitas Malaria Dosis Uji (μg/ml) R % Parasitemia % Pertumbuhan % 0 jam 48 jam Hambatan % Hambatan rata-rata Kontrol (-) 1 1,37 6,99 5,62 - - 2 1,37 7,68 6,31-100 1 1,37 1,09 0 100 100 2 1,37 1,09 0 100 10 1 1,37 1,84 0,47 91,64 91,305 2 1,37 1,94 0,57 90,97 1 1 1,37 2,28 0,91 83,81 81,76 2 1,37 2,65 1,28 79,71 0,1 1 1,37 3,18 1,81 67,79 66,305 2 1,37 3,59 2,22 64,82 0,01 1 1,37 4,67 3,30 41,28 39,105 2 1,37 5,35 3,98 36,93 penghambatan pertumbuhan parasit 50%
Perhitungan Nilai IC 50 Senyawa (1) HO HO O OH O HO O OH FRAKSI ETIL ASETAT Senyawa 1 OH O Cl N HN CH 3 N CH 3 H 3C Klorokuin AKTIF MODERAT AKTIF
Analisis Senyawa Aktivitas senyawa didukung pula adanya gugus atau substituen yang terikat Hubungan struktur dengan aktivitas suatu senyawa dapat ditinjau melalui pada molekul dengan mengikuti keteraturan dari beberapa penelitian-penelitian tiga sebelumnya. aspek (Menurut Hansch, 1968) diantaranya : LIPOFILISITAS Menurut ELEKTRONIK Grazul dkk (2009), pada senyawa quercetin (10) terjadinya pembentukan kompleks dengan ion logam oleh adanya gugus orto-hidroksi, maupun ortohidroksi LIPOFILISITAS dengan karbonil tersebut lebih efektif Lebih dan bersifat stabil dalam non polar meningkatkan HO aktivitas HO suatu Osenyawa sebagai bahan obat. (tidak berada pada bentuk glikosidanya) UKURAN MOLEKUL OH O HO O OH Gugus OH dan karbonil yang berposisi orto dapat membentuk khelat dengan Fe 3+ yang dapat menghambat pembentukan hemozoin sehingga terbentuk heme bebas (Fe 3+ ) yang menyebabkan OH kematian O parasit Senyawa yang memiliki lipofilisitas tinggi memiliki aktivitas antimalaria yang tinggi (Kohler et al., 2001) Senyawa tersebut mudah melalui (masuk) membran sel vakuola makanan parasit
Uji Aktivitas Insektisida Senyawa (1) Hasil Pengamatan Aktivitas Insektisida Senyawa (1) Setelah Pemaparan Selama 24 jam Konsentrasi Hidup Mati Rata-rata hidup Rata-rata mati 400 0 0 10 10 0 10 40 8 8 2 2 8 2 4 10 10 0 0 10 0 0.4 10 10 0 0 10 0
120 100 %mortalitas 80 60 40 20 2.6 1.6 0.6-0.398 0-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3-20 Log konsentrasi Grafik hubungan antara log konsentrasi dengan %mortalitas senyawa (1) TIDAK AKTIF
Uji Aktivitas Insektisida Fraksi Etil Asetat Hasil Pengamatan Aktivitas Insektisida Fraksi Setelah Pemaparan Selama 24 jam Konsentrasi Hidup Mati Rata-rata hidup Rata-rata mati 1000 0 2 1 10 8 9 1 9 500 7 7 6 3 3 4 7 3 250 10 10 10 0 0 0 10 0 125 10 10 10 0 0 0 10 0 62.5 10 10 10 0 0 0 10 0 31.25 10 10 10 0 0 0 10 0
100 80 %mortalitas 60 40 20 3 2.699 2.3979 2.0969 1.7959 1.4949 0-20 0 1 2 3 4 Log konsentrasi Grafik hubungan antara log konsentrasi dengan %mortalitas fraksi etil asetat TIDAK AKTIF
Kesimpulan dan Saran Kesimpulan fraksi etil asetat aktif sebagai antimalaria dengan nilai IC 50 0,027 µg/ml sedangkan senyawa (1) aktif moderat terhadap antimalaria dengan IC 50 0,476 µg/ml apabila dibandingkan dengan kloroquin yang merupakan kontrol negatif. aktivitas insektisida dari senyawa (1) dan fraksi etil asetat dapat dilihat dari nilai LC50. Senyawa (1) memiliki nilai LC 50 125,92 μg/ml sedangkan fraksi etil asetat memiliki nilai LC 50 691,67μg/mL. Keduanya tidak aktif sebagai insektisida. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai hubungan struktur dengan aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit P.falciparum agar dapat diketahui mekanisme kerja senyawa secara pasti. Selain itu penelitian ini perlu dilanjutkan dengan uji toksisitas terhadap hewan uji sehingga dapat memberikan kontribusi di bidang kesehatan.
TERIMA KASIH