Aktivitas Antiplasmodium In Vitro dari Hasil Pemisahan KCV Fraksi etil asetat Umbi Angiopteris evecta Kalimantan Tengah

Transkripsi

1 Aktivitas Antiplasmodium In Vitro dari Hasil Pemisahan KCV Fraksi etil asetat Umbi Angiopteris evecta Kalimantan Tengah Arnida 1*, Wahyono 2, Mustofa 3, R. Asmah Susidarti 2, Sutomo 1 1Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Lambung Mangkurat Kalimantan Selatan 2Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta *Corresponding nida2573@yahoo.co.id ABSTRAK Resistensi Plasmodium terhadap obat malaria mengakibatkan kegagalan pengobatan. Hal ini merupakan ancaman terlebih belum ditemukannya obat alternatif yang efektif untuk melawan resistensi. Tanaman hati tanah (Angiopteris evecta) digunakan oleh masyarakat di Palangkaraya Kalimantan Tengah untuk mengobati malaria. Fraksi etil asetat umbi A. evecta mempunyai aktivitas antiplasmodium in vitro tergolong sangat potensial dengan IC ±0.07 µg/ml. Berdasarkan hal tersebut perlu dilakukan penelusuran golongan senyawa yang beraktivitas sebagai antiplasmodium in vitro. Penelitian dilakukan dengan melakukan pemisahan komponen kimia fraksi etil asetat dengan kromatografi cair vakum (KCV). Uji aktivitas antiplasmodium in vitro dilakukan dengan metode Candle jar. Hasil penelitian diperoleh 5 fraksi yaitu fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5. Fraksi tersebut diuji aktivitas antiplasmodium in vitro masingmasing diketahui rerata nilai IC50 berturut-turut 188,019 ± 6,76 µg/ml; 37,3 ± 0,18 µg/ml; 2,58 ± 0,03 µg/ml; 167,62 ± 3,80 µg/ml; dan lebih dari 200 µg/ml. Fraksi B3 merupakan fraksi dengan nilai IC50 2,58 ± 0,03 µg/ml terendah dibanding dengan fraksi lainnya, dan ditetapkan sebagai fraksi potensial sebagai antiplasmodium in vitro. Hasil penelusuran golongan senyawa diperoleh bahwa pada fraksi B3 adalah golongan glikosida. Kata Kunci: Plasmodium, In vitro, malaria, Hati tanah, Angiopteris evecta PENDAHULUAN Penyebab gagalnya pemberantasan malaria adalah munculnya resistensi Plasmodium terhadap antimalaria dan resistensi vektor terhadap insektisida. Nyamuk Anopheles (vektor) telah resisten terhadap insektisida seperti DDT sehingga mengakibatkan peningkatan jumlah kasus penyakit malaria di beberapa negara tropis (Sherman & Irwin, 2011; WHO, 2012). Penggunaan obat baru sebagai pengganti obat yang mengalami resistensi pada akhirnya terkendala juga dengan timbulnya resistensi terhadap obat tersebut (Hay et al., 2010). Munculnya resistensi Plasmodium terhadap obat malaria mengakibatkan kegagalan pengobatan. Penelitian tentang uji aktivitas antiplasmodium in vitro terhadap tanaman H. spinosa, A. rubiginosa, A.evecta, dan U. crinita yang telah dilakukan oleh Arnida et al. (2015) diperoleh nilai IC50 ekstrak etanol dari H. spinosa, A. rubiginosa, A.evecta, dan U. crinita berturut-turut > 250; 9,38 ± 8,26; 2,86 ± 0,27; dan 25,48 ± 3,10 µg/ml. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa umbi A. evecta memiliki aktivitas antiplasmodium in vitro yang paling kuat. Berdasarkan hal tersebut perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang 205

2 penelusuran senyawa kimia yang berperan pada aktivitas antiplasmodium in vitro. Pada penelitian ini dimaksudkan untuk melakukan pemisahan pada fraksi etil asetat menggunakan kromatografi cair vakum (KCV) dan hasil fraksinasi diuji aktivitasnya sebagai antiplasmodium in vitro menggunakan metode Candle jar (Trager & Jansen, 1976; Moll et al., 2008). METODE PENELITIAN Bahan utama adalah umbi A. evecta yang diambil dari Palangkaraya Kalimantan Selatan pada bulan Januari Bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan fraksinasi dengan grade Sigma adalah etanol, n-heksana, dan etil asetat. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antiplasmodium in vitro adalah P. falciparum strain FCR3 (Laboratorium Farmakologi FK UGM), RPMI, HEPES, NaHCO3, gentamisin, RBC (Red Blood Cell) golongan darah O, natrium klorida 0,9%; 1,6%; 12%, serum darah manusia golongan darah O (Laboratorium Farmakologi FK UGM), gliserol 10%, sorbitol 5%, metanol, DMSO. Kultur Plasmodium Kultur diawali dengan thawing Plasmodium dari cryo tube ke dalam flash kultur, ditambahkan media RPMI, serum, dan RBC lalu diinkubasi pada suhu 370C. Kultur dipertahankan dengan cara mengganti media setiap 24 jam. Apabila parasitemia terlalu tinggi (lebih dari 10%), maka dibuat subkultur dengan menambahkan RBC. Jika kultur Plasmodium telah ditumbuhkan dan mencapai >2% maka dapat dilakukan sinkronisasi untuk pengujian. Preparasi bahan untuk uji Bahan ditimbang lalu ditambahkan 100 µl DMSO dan 900 µl larutan RPMI disterilkan dengan filtrasi menggunakan membrane filter 0,20 µm. Bahan (fraksi) dibuat peringkat konsentrasi 0,1; 0,5; 5; 10; 25; 50; 100; dan 200 µg/ml. Uji Aktivitas antiplasmodium in vitro Bahan uji dan Plasmodium telah siap selanjutnya menyediakan mikroplate (96 sumuran) dan mapping untuk pengujian. Ke dalam mikroplate (sesuai mapping) dimasukkan: 100 µl media RPMI sebagai kontrol negatif, 100 µl larutan uji dan kloroquin sebagai kontrol positif. Campuran Plasmodium 100 µl (hasil sinkronisasi) ditambahkan ke dalam mikroplate yang telah berisi kontrol negatif, larutan uji, dan kontrol positif. Mikroplate dimasukkan dalam candle jar, diinkubasi pada suhu 37oC selama 72 jam. Pada masa inkubasi selesai mikroplate dikeluarkan dari candle jar kemudian dilakukan panen dengan cara campuran dari setiap lubang dipindahkan ke dalam mikro tube, disentrifugasi, supernatan dibuang. Endapan dibuat apusan pada objek gelas, setelah kering apusan diviksasi dengan metanol. Apusan dalam keadaan kering dicat dengan pewarna Giemsa 5%, didiamkan ± 30 menit, dicuci dengan air kran mengalir, dibiarkan kering. Minyak imersi ditambahkan pada apusan, dengan mikroskop dapat dilihat dan dihitung jumlah eritrosit dan parasitemia dari apusan. HASIL DAN DISKUSI 1. Pemisahan dengan KCV 2. Hasil KCV dari fraksi etil asetat umbi A. evecta diperoleh 5 fraksi, fraksi tersebut disebut sebagai fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5. Fraksi B1 secara visual berwarna kuning kehijauan, fraksi B2 berwarna hijau, fraksi B3 berwarna merah tua dan kelihatan ada kristal, 206

3 fraksi B4 berwarna coklat, dan fraksi B5 berwarna coklat tua. Dari 20 g FB yang diisolasi diperoleh fraksi B1 1,12 g; B2 0,51 g; B3 8,87 g; B4 0,22 g, dan B5 4,6 g. Kelima fraksi yang telah diperoleh dilakukan KLT dan uji aktivitas antiplasmodium in vitro. 3. Aktivitas antiplasmodium in vitro 4. Uji aktivitas antiplasmodium in vitro dilakukan terhadap 5 fraksi hasil KCV yaitu fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5. Fraksi B1, B2, B3, B4 dan B5 masingmasing diuji pada peringkat konsentrasi 0,1; 0,5; 5; 10; 25; 50; 100; dan 200 µg/ml. Data persentase parasitemia, persentase, dan IC50 dari fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5 umbi A. evecta, terhadap P. falciparum strain FCR3 dengan masa inkubasi 72 jam terdapat pada Lampiran 6. Rerata persentase parasitemia dari kelima fraksi semakin kecil dengan meningkatnya konsentrasi. Pada konsentrasi kecil yaitu 0,1 µg/ml dari kelima fraksi diperoleh persentase parasitemia lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi lainnya (Tabel 1). 5. Dari hasil perhitungan persentase parasitemia, selanjutnya dilakukan perhitungan persentase Plasmodium. Persentase Plasmodium dihitung dari persentase parasitemia dan kontrol negatif. Hasil perhitungan diperoleh nilai persentase paling besar terdapat pada konsentrasi uji 200 µg/ml dan pada konsentrasi 0,5 µg/ml menunjukkan Plasmodium yang kecil. Pada Gambar 26 memperlihatkan hubungan konsentrasi fraksi terhadap Plasmodium. 6. Fraksi B3 dari konsentrasi 0,1 µg/ml sampai konsentrasi 50 µg/ml memperlihatkan Plasmodium 17,30 ± 0,32%; 19,12 ± 0,52%; 55,66 ± 0,00%; 88,41 ± 2,18%; 98,68 ± 0,70%, 99,44%. Dari konsentrasi 50 µg/ ml ke konsentrasi 100 dan 200 µg/ ml dengan Plasmodium 99,44 ± 0,56% dan 100 ± 0,02%. Fraksi B2 pada konsentrasi 0,1 µg/ ml; 0,5 µg/ ml; dan 5 µg/ ml diperoleh persentase Plasmodium negatif (-) 5,19 ± 0,32%; (-) 4,79 ± 0,56%; dan (-) 4,34 ± 0,32%. Oleh karena itu, konsentrasi tersebut dapat dikatakan tidak mempunyai Plasmodium. Pada konsentrasi berikutnya yaitu 10 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml; dan 100 µg/ml memperlihatkan adanya Plasmodium 21,33 ± 0,31%; 22,79 ± 0,10%; 40,56 ± 3,25%; dan 97,96 ± 1,16%, dan pada konsentrasi 200 µg/ml dengan Plasmodium 99,26 ± 0,32%. Fraksi B4 memperlihatkan Plasmodium dari konsentrasi 0,1; 0,5; 5; 10; 25; 50; 100; dan 200 µg/ml adalah (-)9,10 ± 1,16%; (-)6,31 ± 1,16%; (-)3,60 ± 0,56%; (-)0,26 ± 0,56%; 9,58 ± 1,16%; 27,78 ± 1,40%; 207

4 32,05 ± 1,11%; 52,10 ± 0,56%. Pada fraksi B5 Plasmodium hanya diperoleh dari konsentrasi 100 dan 200 µg/ml dengan nilai yang kecil yaitu 0,75 ± 1,89% dan 15,56 ± 1,64%. Dari kelima fraksi, hanya fraksi B3 yang memperlihatkan adanya Plasmodium pada konsentrasi terkecil (0,1 µg/ml), sedangkan fraksi B1, B2, B4, dan B5 diperoleh nilai presentase di bawah 0 yang berarti tidak memberi Plasmodium. Tabel 1. Rerata persentase parasitemia pemberian fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5 umbi A. evecta terhadap kultur P. falciparum strain FCR3 inkubasi selama 72 jam Bahan Uji Konsentrasi (µg/ml) Rerata % Parasitemia ±SD Rerata % Penghambatan ±SD Rerata IC50 ± SD Kontrol 17,94 ± 0,11 B1 0,1 27,18 ± 0,17-51,55 ± 0,95 > 200 0,5 26,80 ± 0,10-49,43 ± 0, ,07 ± 0,00-45,36 ± 0, ,69 ± 0,00-9,81 ± 0, ,78 ± 0,04 0,85 ± 0, ,33 ± 0,05 25,69 ± 0, ,08 ± 0,36 28,04 ± 0, ,80 ± 0,10 50,93 ± 0,55 B2 0,1 18,87 ± 0,05-5,20 ± 0,32 37,13 ± 0,22 0,5 18,83 ± 0,11-4,79 ± 0, ,72 ± 0,05-4,34 ± 0, ,11 ± 0,05 21,33 ± 0, ,85 ± 0,05 22,79 ± 0, ,66 ± 0,58 40,56 ± 3, ,37 ± 0,20 97,96 ± 1, ,13 ± 0,05 99,26 ± 0,32 B3 0,1 14,83 ± 0,05 17,30 ± 0,32 4,48 ± 0,01 0,5 14,51 ± 0,09 19,12 ± 0,54 5 9,22 ± 0,44 55,66 ± 0, ,95 ± 0,00 88,41 ± 2, ,08 ± 0,39 98,68 ± 0, ,24 ± 0,12 99,44 ± 0, ,10 ± 0, ± ,00 ± 0,00 100,00 ± 0,02 B4 0,1 19,57 ± 0,20-9,10 ± 1,16 > 200 0,5 19,07 ± 0,21-6,31 ± 1, ,58 ± 0,10-3,60 ± 0, ,98 ± 0,10-0,26 ± 0, ,22 ± 0,21 9,58 ± 1, ,95 ± 0,25 27,78 ± 1, ,19 ± 0,20 32,05 ± 1, ,59 ± 0,09 52,10 ± 0,55 B5 0,1 21,27 ± 0,15-18,58 ± 0,85 > 200 0,5 20,66 ± 0,21-15,23 ± 1, ,38 ± 0,09-8,07 ± 0, ,25 ± 0,11-7,34 ± 0, ,12 ± 0,25-6,60 ± 1, ,39 ± 0,01-2,53 ± 0, ,80 ± 0,34 0,75 ± 1, ,15 ± 0,29 15,56 ± 1,64 208

5 Dari data persentase Plasmodium kelima fraksi kemudian dilakukan analisis probit untuk menentukan IC50. Fraksi B1, B2, B3, B4, dan B5 masing-masing diketahui rerata nilai IC50 berturut-turut lebih dari 200 µg/ml; 37,13 ± 0,22 µg/ml; 4,48 ± 0,01 µg/ml; lebih dari 200 µg/ml; dan lebih dari 200 µg/ml (Tabel 1). Uji statistik terhadap nilai IC50 dilakukan dengan menggunakan uji Anova satu jalan dilakukan terhadap kelima fraksi. Hasil uji diperoleh perbedaan nilai yang signifikan antara kelima fraksi. Uji statistik dilanjutkan dengan post hoc test untuk mengetahui perbedaan antar kelompok fraksi. Hasil post hoc test didapatkan perbedaan yang bermakna antara semua fraksi B1 terhadap fraksi B2, B3, B4, B5 (p = 0.00); fraksi B2 terhadap fraksi B1, B3, B4, B5 (p = 0,00); fraksi B3 terhadap fraksi B1, B2, B4, B5 (p = 0,00); fraksi B4 terhadap fraksi B1, B2, B3, B5 (p = 0,00); fraksi B5 terhadap fraksi B1, B2, B3, B4, B5 (p = 0,00). Dari kelima fraksi yang telah ditentukan nilai IC50 diperoleh fraksi yang memiliki IC50 terkecil diantara fraksi lainnya yaitu fraksi B3. Aktivitas antiplasmodium in vitro dinyatakan sangat aktif atau sangat potensial jika memiliki nilai IC50 < 5 µg/ml (Gessler et al., 1994; Munoz et al. 1999; Karov et al., 2003; Bickii et al., 2007), tergolong aktif jika nilai IC50 berkisar 5-50 µg/ml (Karov et al., 2003, Bickii et al., 2007), kurang aktif bila IC μg/ml dan tidak aktif jika IC50 > 100 μg/ml (Bickii et al., 2007). Nilai IC50 fraksi B3 adalah 4,48 ± 0,01 µg/ml menunjukkan bahwa B3 memiliki aktivitas antiplasmodium in vitro terbesar dibandingkan dengan fraksi B1, B2, B4, dan B5. KESIMPULAN Aktivitas antiplasmodium in vitro fraksi-fraksi dikategorikan berdasarkan nilai IC50 adalah fraksi B1, B4, dan B5 tergolong tidak aktif (lebih dari 200 µg/ml), fraksi B2 tergolong aktif (37,13 ± 0,22 µg/ml), dan fraksi B3 tergolong sangat aktif (4,48 ± 0,01 µg/ml). UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, Rektor Universitas Lambung Mangkurat, Dekan Fakultas MIPA Unlam, Ketua Program Studi Farmasi Unlam atas dukungan pembiayaan, fasilitas dan bantuan lainnya. Arnida, Wahyono, Mustofa, & Susidarti, R.A., 2015, In vitro antiplasmodial activity of ethanol extracts of Borneo medicinal plants (Hydrolea spinosa; Ampelocissus rubiginosa; Uraria crinite; Angiopteris evecta), Int J of Pharm and Pharma Sci. 7(5): Bickii, J., Tchouya, G.R.F., Tchouankeu, J.C., & Tsamo, E., 2007, Antimalarial activity in crude extracts of some cameroonian medicinal plants, Afr J Trad CAM., 4 (1): Gessler, M.C., Nkunya, M.H.H., Mwasumbi, L.B., Heinrich, M., & Tanner, M., 1997, Screening Tanzanian medicinal plants for antimalarial activity, Acta Tropica, 56(1): Hay, S.I., & Snow, R.W., 2006, The malaria atlas project: geveloping global maps of malaria risk, PLoS Med, 3(12): e473. DAFTAR PUSTAKA Karov, D., Dicko, M.H., Sanon, S., Simpore, J., & Traore, A.S., 2003, Antimalarial activity of Sida acuta Burm.f (Malvaceae) and Pterocarpus erinaceus Poir (Fabaceae), J Ethnopharmacol, 89: Moll, K., Ljungstrom, I., Perlmann, H., Scherf, A., & Wahlgren, M., 2008, Methods in Malaria Research, University Boulevard, Manassas, Sherman & Irwin, W., 2011, Magic Bullet to conguer malaria: from quinine to Qinghaosu, ASM Press, US., p. 225 Trager, W., & Jensen, J.B., 1976, Human malaria parasites in continous culture, Science, 193: WHO, 2012, Word Malaria Report, WHO Press, Geneva,