I. Bidang Keanekaragaman Hayati SB/O/KR/01 ANALISIS KERAGAMAN GENETIK MUTAN ANGGREK Phalaenopsis amabilis (L.) Blume DENGAN RAPD Rahayu Sulistianingsih 1), Endang Semiarti 2 ), Aziz Purwantoro 3 ) dan Woerjono Mangoendidjojo 3 ) 1) Fakultas Pertanian UPN; Email: r.sulistya@gmail.com 2) Fakultas Biologi UGM 3) Fakultas Pertanian UGM ABSTRAK Hasil Varietas baru dapat dirakit melalui beberapa cara, antara lain melalui mutasi induksi untuk mendapatkan mutan yang diinginkan Untuk mendapatkan kultivar baru anggrek alam Phalaenopsis amabilis (L.)Blume telah dilaksanakan iradiasi sinar gamma Co- 60. Hasil iradiasi menunjukkan keragaman fenotip, sehingga perlu dilakukan penelitian secara biologi molekuler untuk mengetahui apakah keragaman fenotip tersebut memang disebabkan karena adanya perbedaan genotip pada tanaman-tanaman hasil iradiasi tersebut. Dalam penelitian ini dilakukan analisis keragaman genetik antar individu dalam populasi tanaman hasil iradiasi dengan menggunakan teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Bahan tanaman berupa hasil iradiasi sinar gamma 0. 15, 20, 25 20+20 dan 40 Gray. Masing-masing diisolasi DNA genom dari tanaman tersebut dan diamplifikasi dengan 26 primer yang ditentukan secara random. Hasil PCR (Polymease Chain Reaction) dianalisis dengan elektrophoresis dengan 1.5 % agarose. Analisis DNA dilakukan dengan teknik RAPD menggunakan 12 primer terseleksi dari 26 primer yang digunakan.analisis polimorfis dan keragaman molekuler dianalisis dengan metode Nei s gene diversity dengan program GenAlEx 6.1. Hasil penelitian menunjukkan Keragaman genetik dapat dianalisis pada awal pertumbuhan tanaman anggrek bulan alam Phalaenopsis amabilis (L.) Blume hasil iradiasi sinar gamma Co-60 dengan menggunakan teknik RAPD dan Primer OPA2, OPB1, OPB6, OPB 10 dapat digunakan sebagai penanda untuk menunjukkan mutasi yang terjadi pada anggrek bulan alam Phalaenopsis amabilis (L.) Blume hasil iradiasi sinar gamma Co-60 Kata kunci : Analisis Keragaman Genetik, Mutan Anggrek, RAPD PENDAHULUAN Anggrek bulan yang paling terkenal adalah Phalaenopsis amabilis (L.) Blume. yang mempunyai bunga besar, berwarna putih, membulat seperti bentuk kupu-kupu dengan antena yang kuning, dengan untaian yang tersusun sempurna, bunganya tahan lama dan berbunga sepanjang waktu. Keistimewaan ini menjadikan Phal. amabilis (L.) Blume populer sebagai tanaman induk dalam persilangan (Sweet, 1980; Arditti, 1992; Cullen, 1992; Direktorat Budidaya Tanaman Hias, 2005). Dalam suatu populasi, perbedaanperbedaan pada sejumlah individu selalu dijumpai. Perbedaan pada individu ini dikenal dengan variasi biologi, yang dapat dibedakan menjadi dua katagori. Katagori yang pertama ialah variasi yang disebabkan adanya pewarisan sifat atau pewarisan genetik dan katagori yang kedua variasi yang disebabkan adanya faktor-faktor 46 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

lingkungan (Welsh, 1991). Pengukuran dan evaluasi variabilitas menjadi penting jika ingin memahami pengendalian genetik dalam sistem biologi. Kekerabatan secara fenotipik, yaitu kekerabatan yang berdasarkan set karakter yang dimiliki suatu organisme yang memiliki sifat genetik yang dipengaruhi oleh lingkungan, dapat diukur berdasarkan kemiripan sejumlah karakter (Kartikaningrum, 2002). Evaluasi keragaman genetik dapat dilakukan dengan penanda morfologis, biokimia dan molekuler (Solouki et al., 2008). Pemanfaatan penanda molekuler dengan DNA sebagai alat bantu seleksi Marker Assisted Selection (MAS) lebih menguntungkan dibandingkan dengan seleksi secara fenotipik (Ishak, 1998; Azzrai, 2005). Pengukuran keragaman spesies tanaman dapat dilakukan dengan karakter genetik diantaranya adalah RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism), RAPD (Random Amplified polymorphic DNA), dan AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorfism). Penggunaan RAPD adalah penanda berbasis PCR (Polymease Chain Reaction) dengan menggunakan sekuen-sekuen nukleotida sebagai primer merupakan cara umum yang digunakan untuk membantu mengetahui adanya mutasi tanpa harus melihat fenotipnya (Hughes, 1996). Mutasi yang terjadi pada tingkat DNA genom dapat dideteksi dengan penanda molekuler, dengan teknik Random Amplified Polymorphic DNA( RAPD). Dalam penelitian akan dilakukan analisis variasi genetik hasil iradiasi sinar gamma Co-60 pada hasil tanaman yang berasal buah anggrek bulan alam Phalaenopsis amabilis (L) Blume. dengan teknik RAPD. Keragaman genetik dapat diketahui lebih awal sehingga langkah ini akan mempersingkat waktu pemulia tanaman dalam memperoleh kultivar baru pada tanaman anggrek bulan. BAHAN DAN CARA KERJA Metode Penelitian yang dilaksanakan merupakan metode laboratorium dengan rancangan penelitian acak lengkap (Completely Randomized Design/RAL) dengan 6 perlakuan berupa planlet anggrek alam Phalaenopsis amabilis hasil radiasi penelitian sebelumnya yaitu, 0 tanpa iradiasi; iradiasi 15, 20 ; 25; 40 dan 20+20 gray dengan empat sampel. Waktu pelaksanaan penelitian mulai bulan Mei sampai dengan Oktober 2009 di Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian UGM. Pelaksanaan penelitian dilakukan dengan mengekstraksi DNA hasil iradiasi yang tumbuh dari buah anggrek alam Ph. amabilis menggunakan daun segar planlet anggrek terpilih dengan metode CTAB (Doyle & Doyle, 1990) yang telah Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 47

dimodifikasi (Subandiyah, 2003). Sampel daun segar sebanyak 0.1 gram. Hasil ekstraksi dipurifikasi menggunakan GeneClean@III Kit (MP Biomedical). Amplifikasi dilakukan dengan reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan alat Gene Amp PCR System 9700, bertujuan menggandakan sekuen berdasarkan primer yang digunakan. Reaksi PCR dilakukan pada total volume 20 µl untuk setiap tabung PCR dengan menggunakan PCR mix FastStart PCR Master (Roche), terdiri atas Taq DNA polymerase, MgCl2, Buffer reaksi dan dntps sebanyak 10 µl, 1 µl primer (Sigma-Proligo), 2 µl DNA sampel dan 7 µl akuades steril. Amplifikasi dilakukan dengan pemanasan pertama dilakukan pada suhu 95 o C selama 1 menit dengan siklus 45 kali dengan suhu dan waktu selama siklus sebagai berikut: denaturasi pada 95 o C selama 45 menit, annealing pada suhu 37 o C selama 1 menit, Elongasi awal pada suhu 72 o C selama 1 menit 30 detik, elongasi akhir 72 o C selama 7 menit. DNA hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1.5 % (b/v) yang telah dipanaskan dan ditambahkan dengan buffer TBE 1x dan dicetak dalam cetakan. DNA (BioRad-mini sub cell GT) ditambahkan loading dye untuk pewarna sebanyak 2 µl/ 10 µl dan untuk marka digunakan 100bp microzone dengan tegangan 100 volt selama 45 menit kemudian direndam dengan Ethium bromide selama 30 menit kemudian dibilas dengan aquades Hasil elektroforesis divisualisasi dengan sinar UV dari UV trans illuminator dan dilakukan pemotretan menggunakan kamera digital Olympus Primer yang digunakan untuk screening telah dilaksanakan dengan 26 primer yang dipilih secara acak. Dari hasil screening terpilih 12 primer yang menunjukkan pola pita polimorfism. Data diperoleh di skoring yaitu ada (1) atau tidak ada (0) pita dari setiap individu pada ukuran tertentu untuk setiap primer. Dari data tersebut dapat diketahui jumlah dan persentase lokus polimorfik. Nilai keragaman genetik (h) untuk setiap perlakuan dihitung berdasarkan Nei s gene diversity (1973) dilakukan dengan program Gen AlEx 6 (Peakall & Smouse,2005). HASIL DAN PEMBAHASAN Teknik mutasi diakui sebagai metoda yang efektif dalam meningkatkan keragaman genetik tanaman Iradiasi dengan sinar gamma Co-60 dapat meningkatkan keragaman fenotip dan genotip. Keragaman genetik dapat diamati secara morfologi maupun secara molekuler. Hal ini terjadi karena perubahan segmen ataupun adanya sisipan segmen pada kromosom lain tidak dapat teramati dengan penggunaan mikroskop. Keragaman genetik yang terjadi akibat mutasi dapat dideteksi pada level 48 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

molekuler dengan menggunakan teknik sidik jari DNA. Penempelan primer dan amplifikasi suatu lokus DNA disebabkan adanya pasangan basa nukleitida komplementer primer yang digunakan pada untai DNA. Muncul tidaknya suatu lokus pada sampel tanaman dapat disebabkan oleh perbedaan susunan basa nukleitida pada DNA sampel sehingga primer yang sama tidak dapat menempel dan oleh karena itu tidak dapat mengamplifikasi lokus tersebut. Perbedaan inilah yang dikenal dengan polimorfisme. Dengan teknik RAPD dapat dilihat polimorfisme yang ditemukan pada tanaman wild-tipe (control) dengan tanaman anggrek bulan alam Ph. amabilis yang diiradiasi. Pada gambar 1 menunjukkan perubahan susunan nukleitida DNA dari tanaman hasil iradiasi dengan bentuk yang sama lanset dengan control sebagai salah satu contoh C2 dan E4 menunjukkan morfologi yang sama dengan kontrol tetapi dengan teknik RAPD menggunakan primer OPA2 menunjukan pola pita yang berbeda. Ada penambahan pita baru yang komplementer dengan primer OPA2 yang tidak didapatkan pada tanaman kontrol. Sependapat dengan Harahap (2006) yang menyatakan perlakuan iradiasi dapat menyebabkan munculnya pita baru dan kehilangan pita dibandingkan tanaman kontrol. Perlakuan A( 15 Gray) perubahan bentuk daun pada planlet hasil iradiasi menunjukkan adanya penambahan pita di 300, 400, 500, 600, 700 dan 800 bp, begitu juga untuk planlet hasil iradiasi pada dosis yang berbeda mucul pita yang baru yang tidak ada pada kontrol. Tabel 2 menunjukkan keragaman didalam populasi pada masing perlakuan berdasarkan analisis keragaman dari 12 primer yang diujikan seperti ditampilkan pada lampiran. Analisis keragaman genetik berdasarkan Nei s gene diversity dilakukan dengan program GenAlEx6.1 ditunjukkan pada table 2. Keragaman dihitung berdasarkan frekuensi alel (1 dan 0) dan jumlah lokus polimorfik, yang menunjukkan keragaman genetik dalam populasi tanaman yang diiradiasi dengan sinar gamma Co-60. Hal ini menyebabkan nilai koefisien keragaman sejalan dengan nilai persentase lokus polimorfik, yaitu semakin tinggi persentase lokus yang polimorfik semakin tinggi koefisien keragaman yang timbul. Polimorfisme yang terjadi dari analisis RAPD ditujukkan dengan terbentuknya pita DNA pada individu satu sementara pada individu lain tidak terbentuk pita pada posisi atau ukuran yang sama. Dengan adanya polimorfisme primer akan menunjukkan tingkat keragaman genetik. Pada semua primer yang diujikan pita DNA yang terbentuk antara 100 sampai 1200 bp. Tanaman Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 49

kontrol hanya teramplifikasi pada OPA4 di 500 700bp, OPB7 di 350 bp dan OPS 12 terukur di 550-1000 bp. Sedangkan primer OPA2, OPB1, OPB6 dan OPB 10 tidak memunculkan pita DNA yang spesifik sehingga pada sampel tanaman lain yang teramplifikasi oleh primer tersebut sudah menunjukkan adanya mutasi di tingkat gena. Gambar 2 menunjukkan keragaman genetik di dalam populasi cukup besar sehingga dapat menjadi pool mutan untuk digunakan sebagai material pemuliaan tanaman lebih lanjut. Berdasarkan scater plot hasil analisis keragamanan genetik (gambar 3) berbagai primer yang diujikan menunjukkan planlet hasil iradiasi sinar gamma sudah terjadi perubahan genetik dan sudah berbeda dengan planlet control (0 gray). Planlet kontrol berkelompok, sedangkan mutan hasil iradiasi yang lain tersebar di ke empat koordinat yang lain berarti mutan yang terbentuk dapat digunakan sebagai material pemuliaan dan keragaman genetik Phalaenopsis amabilis dapat meningkat dengan perlakuan iradiasi sinar gamma. KESIMPULAN: 1. Keragaman genetik dapat ditingkatkan dengan iradiasi sinar gamma Co-60 pada tanaman anggrek bulan alam Phalaenopsis amabilis (L.) Blume 2. Keragaman genetik dapat dianalisis pada awal pertumbuhan tanaman anggrek bulan alam Phalaenopsis amabilis (L.) Blume hasil iradiasi sinar gamma Co-60 dengan menggunakan teknik RAPD. 3. Perlakuan iradiasi 15 dan 40 gray dengan sinar gamma memberikan persentase lokus polimorfism yang tertinggi di 12 primer yang diujikan. UCAPAN TERIMA KASIH: Diucapkan terima kasih kepada Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat UGM yang telah membiayai penelitian ini melalui Dana Hibah untuk Mahasiswa Program Doktor Tahun anggaran 2009 (Dana DIPA UGM). DAFTAR PUSTAKA Aisyah, S.I. 2006. Mutasi Induksi Fisik Dan Pengujian Stabilitas Mutan Yang Diper-banyak Secara Vegetatif Pada Anyelir ( Dianthus caryophyllus Linn.) Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Disertasi. Arditti, J. 1992. Fundamental of Orchid Biology. John Willey & Sons. Canada. Azrai, M. 2005. Pemanfaatan markah molekuler dalam Proses Seleksi Pemuliaan Tanaman. J.Agro- Biogen 1(1) 26-37 Cullen, J. 1992. The Orchid Book : a Guide to The Identification of Cultivated Orchid Species. 1 st ed. Cambridge Univ Press. 50 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

Direktorat Budidaya Tanaman Hias. 2005. Standar Prosedur Operasional Anggrek Phalaenopsis. Direktorat Jenderal Hortikultura. 42p. Harahap, F., E. Guhardja, R. Poerwanto, G.A. Wattimena dan Suharsono. 2006. Induksi Mutasi Pada Kultur Tanaman Manggis (Garcinia Mangostana) dengan radiasi Sinar Gamma dan Analisis Perubahan DNA dengan Penanda Molekuler. Pross. Sem. Nas. PERAGI.p 445-453. Hughes, M.A. 1996. Plant Molecular Genetik First ed. Longman. United of Kingdom.p3. Ishak. 1998. Identifikasi Keragaman DNA genom Mutan Padi Atomita-2 dan tetuanya menggunakan RAPD Marker. Zuriat, 9(2); 91-99 Kartikaningrum, S. 2002. Isolasi DNA anggrek dan Seleksi Primer melalui Teknik Random Amplified Polymorphic DNA. Pross. Seminar Nasional Anggrek. 22 Oktober 2002. Peakall, R. & P.E. Smouse, 2005 GenAlEx 6: Genetik Analysis in Exel. Population genetik software for teaching and research. Australian Antional University, Canberra, Astralia. http://www.anu.edu.au/bozo/gen AlEx/ Piluck, C. and S. Lamseejan. 2002. Orchid Improvment through Mutation Induction by Gamma rays. Workshop on Induced Mutation Technique for Genetik Diversity and Economic Crop Improvement-II.4p. Solouki, M.,H., Mehdikhani, H. Zeinali & A.A. Emamjomeh, 2008. Study of Genetik Diversity in Chamomile (Matricaria chamomilla) based on morphological traits and molecular markers. Sci. Hortic Sweet, H.R. 1980. The Genus Phalaenopsis. The Orchid Digest Inc. U.S.A. p.128. Welsh, J.R. 1991. Dasar-dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman, Alih bahasa: J.P. Mogea, Penerbit Erlangga. 224p. Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 51

Tabel 1. Primer hasil seleksi yang digunakan dalam amplifikasi DNA tanaman Anggrek Bulan Alam Phalaenopsis amabilis (L.) Blume. Hasil iradiasi Sinar Gamma Co-60, jumlah lokus teramplifikasi dan polimorfik yang dihasilkan. No Primer Sekuen Jumlah Lokus polimorfik Jumlah lokus teramplifikasi 1 OPA2 5 TGCCGAGCTG 11 14 2 OPA4 5 AATCGGGCTG 2 4 3 OPA9 5 GGGTAACGCC 9 13 4 OPA10 5 GTGATCGCAG 10 10 5 OPA13 5 CAGCACCCAC 5 6 6 OPB1 5 GTTTCGCTCC 8 9 7 OPB5 5 GATGACCGCC 13 15 8 OPB6 5 TGCTCTGCCC 10 14 9 OPB7 5 GGTGACGCAG 11 13 10 OPB10 5 CTGCTGGGAC 10 12 11 OPH18 5 GAATCGGCCA 14 22 12 OPS12 5 CTGGGTGAGT 14 17 TOTAL 117 149 Tabel 2. Hasil Analisis Keragaman Mutan Anggrek Ph. amabilis (L) Blume yang di-iradiasi pada berbagai dosis sinar gamma Co-60. Populasi % Lokus polimorfism jumlah sampel (N) Jumlah Alel yang berbeda (Na) Jumlah Alel efektif (Ne) Keragaman (h) Kontrol 13.21 4 0.340 1.079 0.050 15 gray 55.66 4 1.123 1.394 0.228 20 gray 44.34 4 0.896 1.311 0.180 25 gray 42.45 4 0.858 1.330 0.183 40 gray 52.83 4 1.075 1.351 0.209 20 +20 gray 31.13 4 0.623 1.213 0.125 Rerata 39.94 4 0.819 1.280 0.162 SE 6.41 0 0.039 0.014 0.008 52 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

M K A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 C1 C2 C3 C4 D1 D2 D3 D4 E1 E2 E3 E4 K M Gambar 1. Hasil amplifikasi DNA Anggrek Bulan Alam Ph. amabilis (L) Blume yang diiradiasi dengan sinar gamma Co-60 pada berbagai dosis (0, 15, 20,25,40 dan 20+20 gy) dengan primer OPA2. Keterangan : M ; Marka, K,: Wild tipe (Kontrol,) A1:15 gy daun asimetris; A2: 15 gy daun fusi; A3:15 gy daun bergelombang;a4: 15 gy daun membulat. B1: 20 gy daun bulat; B2:20gy bergelombang; B3: 20 gy daun beralur tebal, B4 20 gy lanset. C1: 25 gy:daun rosset, C2;25 gy daun lanset, C3: 25 gy daun tidak membuka sempurna, C4:25 gy Daun bulat tebal. D1:40 gy Bulat tebal, D2:40gy daun mlintir, D3:40gy Daun kriting, D4:40gy daun rosset. E1: 20+20 gy Daun Bulat. E2:20+20 daun Fusi, E3: Ujung daun terbelah, E4: 20+20 gy daun Lanset tebal. 18% 82% Among Pops Within Pops Gambar 2. Grafik persentase keragaman genetik Anggrek Bulan Alam Phalaenopsis amabilis dengan dosis iradiasi sinar gamma Co-60 dengan menggunakan berbagai macam primer dengan teknik RAPD. Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 53

Principal Coordinates E4 B3 E3 Coord. 2 B4 E1 F1 E2 D3 F4 C3 F2 B2 D4 C4 F3 B1 C2 C1 A2 A4 A1 A3 kontrol Prlk 15 gy Prlk 20 gy Prlk 25 gy Prlk 40 gy D1 D2 Prlk 20+20 gy Coord. 1 Gambar 3. Scater Plot planlet hasil iradiasi berdasarkan matriks kovarian berbagai primer yang diujikan. 54 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010