BAB III BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 BAB III BAHAN DAN METODE 3.. Tempat dan Waktu Tempat penelitian analisis DNA dilakukan di Common Laboratory SEAMEO BIOTROP dan laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bukan Februari 0 sampai dengan Januari Bahan dan Alat Penelitian 3... Bahan Penelitian Bahan tanaman yang digunakan berupa daun sengon yang berasal dari tegakan yang diambil secara acak di beberapa hutan rakyat di Jawa. Adapun daerah-daerah pengambilan sampel dapat dilihat pada Tabel. Tabel Lokasi tempat pengambilan sampel daun sengon pada hutan rakyat di Jawa Provinsi Kota/ Kabupaten Jumlah Sampel Cianjur 5 Sukabumi 5 Jawa Barat Garut 5 Subang 5 Kuningan 5 Tasikmalaya 5 Jawa Tengah Wonosobo 5 Kediri 5 Jawa Timur Lumajang 5 Total 5 Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran. Adapun secara garis besar bahan-bahan yang digunakan adalah: Nitrogen cair, buffer ekstrak CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide), β Mercaptoethanol, GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari SIGMA, Chloroform: Isoamylalcohol, phenol, aquabidest, isopropanol dingin, etanol 70% dan buffer TE. Pada proses PCR bahan-bahan yang digunakan adalah: DNA template, Nuclease free water, primer random dan pereaksi PCR (dntp, Taq polymerase, Buffer PCR, dan MgCl ). Adapun bahan-bahan yang digunakan

2 dalam visualisasi DNA yaitu, agarose, aqudest, buffer TAE, loading dye, DNA marker, Etbr atau SYBR safe gel stain DNA. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran Prosedur Penelitian Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, proses PCR yang menghasilkan RAPD, skoring dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar. Sample (daun) Ekstraksi DNA Tidak Elektroforesis agar %, V : 00 Volt PCR (seleksi primer random) PCR (seleksi primer) PCR (primer terbaik) Tidak Elektroforesis (Agar,5%, V : 00 volt) Foto Interpretasi dan Analisis Data deskriptif POPGEN NTSYS S Gambar Bagan tahapan penelitian Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Dalam penelitian ini, ekstraksi DNA Sengon dilakukan dengan dua metode, yaitu metode CTAB dan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit

3 dari SIGMA. Metode CTAB menggunakan larutan buffer CTAB (Tris-HCL M, NaCl 5M, EDTA 0,5 M dan CTAB 0%), dipilih karena lebih murah dan mudah dilakukan (Rogers and Bendich 994, diacu dalam Aritonang et al. 007). Adapun langkah awal yang dilakukan dari metode ini hampir sama yaitu, sampel daun Sengon 0,5 0,5 g digerus dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tube ml yang telah diisi ml buffer ekstrak CTAB dan % β-mercaptoethanol. Campuran divortex ± menit, kemudian diinkubasi 65 0 C selama 30 menit (setiap 0 menit campuran dihomogenkan dengan membolakbalikan tabung). Larutan ekstrak DNA dipurifikasi dengan menambahkan 750 µl Chloroform, lalu campuran divortex dan disentrifugasi pada kecepatan.000 rpm selama 0 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahanbahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Dari kedua fase tersebut yang digunakan untuk tahap selanjutnya adalah fase air yang berisi benang-benang nukleat. Supernatan dipipet kedalam tube ml yang baru, proses purifikasi dilakukan sebanyak dua kali, hal ini bertujuan untuk memperoleh DNA yang memiliki tingkat kemurnian tinggi. DNA diendapkan dengan penambahan ml isopropanol dingin. Kemudian dihomogenkan perlahan sampai terbentuk benang-benang putih. Campuran diinkubasi pada suhu -0 o C selama minimal 30 menit, kemudian pelet di sentrifugasi pada kecepatan.000 rpm selama 0 menit. Setelah itu pelet DNA dilarutkan dengan buffer TE. Selain itu dalam penelitian ini dilakukan juga modifikasi metode ekstraksi DNA menggunakan buffer CTAB dan menggunakan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari SIGMA. Dimana setelah mendapatkan supernatan dari ektraksi DNA dengan penggunaan buffer CTAB dilakukan load lysate dengan menambahkan column preparation 700 µl kedalam binding column. Setelah itu dilakukan first column wash dengan menambahkan wash solution sebanyak 500 µl. Adapun tahap terakhir yaitu tahapan elute DNA dengan menambahkan elution solution sebanyak 00 µl. Karakteristik pita DNA dapat diamati dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar %. Gel yang telah dieletroforesis direndam di dalam Etbr x selama 30 menit. Gel divisualisasikan di dalam KODAK Gel Logic 00.

4 3.3.. PCR (Polymerase Chain Reaction) Proses amplifikasi DNA pada PCR membutuhkan bahan campuran yang terdiri dari buffer PCR, MgCl, dntp yang digunakan sebagai sumber nukleotida pada proses PCR (gabungan datp, dgtp, dctp dan dttp), Taq DNA polymerase, DNA hasil isolasi dan Nuclease Free Water (Tabel ). Sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA tamplate dengan Nuclease Free Water. Hal ini tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi. Mengacu pada Promega (003), jumlah DNA yang diperlukan dalam proses PCR sangat sedikit yaitu sekitar μl atau 0 ng/μl. Untuk mengetahui konsentrasi DNA hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh primer oligonukleotida yang digunakan. Tabel Komponen bahan untuk reaksi PCR. No Nama Bahan Sampel Reaksi DNA target Primer PCR buffer MgCl dntp Taq DNA polymerase Nuclease free water Total Volume µl,5 µl 5 µl,5 µl 0,5 µl 0, µl 3,3 µl 5 µl Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Adapun tahapan PCR yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Tahapan proses PCR Tahapan Pre-denaturation Denaturation Annealing Extension Final Extension Suhu Waktu ( o C) (menit) Jumlah Siklus

5 Seleksi Primer Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan yang biasanya terdiri antara 0 5 nukleotida (Finkeldey 005). Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang sebesar 0-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang kurang dari 0-mer dapat digunakan tetapi akan menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya. Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan seleksi terhadap primer, yaitu golongan OPO, OPY, OPA, OPB, OPC dan OPD yang diproduksi oleh Operon Technology. Urutan basa primer yang dicobakan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Urutan basa nukleotida 4 primer (Operon Technology) yang dicobakan. No Primer Urutan Nukleotida No Primer Urutan Nukleotida OPA- CAGGCCCTTC OPC- GTGAGGCGTC OPA- TGCCGAGCTG OPC-3 GGGGGTCTTT 3 OPA-3 AGTCAGCCAC 3 OPC-4 CCGCATCTAC 4 OPA-4 AATCGGGCTG 4 OPC-5 GATGACCGCC 5 OPA-6 GGTCCCTGAC 5 OPC-6 GAACGGACTC 6 OPA-7 GAAACGGGTG 6 OPC-7 GTCCCGACGA 7 OPA-8 GTGACGTAGG 7 OPC-8 TGGACCGGTG 8 OPA-9 GGGTAACGCC 8 OPD- ACCGCGAAGG 9 OPA-0 GTGATCGCAG 9 OPD- GGACCCAACC 0 OPB- GTTTCGCTCC 30 OPD-3 GTCGCCGTCA OPB- TGATCCCTGG 3 0PD-4 TCTGGTGAGG OPB-3 CATCCCCCTG 3 OPD-5 TGAGCGGACA 3 OPB-4 GGACTGGAGT 33 OPD-6 ACCTGAACGG 4 OPB-5 TGCGCCCTTC 34 OPD-7 TTGGCACGGG 5 OPB-6 TGCTCTGCCC 35 OPD-8 GTGTGCCCCA 6 OPB-7 GGTGACGCAG 36 OPD-9 CTCTGGAGAC 7 OPB-8 GTCCACACGG 37 OPD-0 GGTCTACACC 8 OPB-9 TGGGGGACTC 38 OPU-5 TTGGCGGCCT 9 OPB-0 CTGCTGGGAC 39 OPY-5 GGCTGCGACA 0 OPC- TTCGAGCCAG 40 OPY-3 ACAGCCTGCT Dari hasil seleksi primer yang dilakukan hanya diambil 5 primer yaitu OPA-, OPA-3, OPB-0, OPY-5 dan OPU-5. Urutan nukleotida dari masing-masing 4

6 primer adalah OPA- (TGCCGAGCTG), OPA-3 (AGTCAGCCAC), OPB-0 (CTGCTGGGAC), OPY-5 (GGCTGCGACA) dan OPU-5 (TTGGCGGCCT). Hasil dari proses PCR tersebut dianalisis dengan melakukan proses elektroforesis menggunakan,5% gel agarose dalam larutan buffer TAE x dan distaining dengan menggunakan SYBR safe gel stain DNA Skoring Fragmen RAPD Hasil PCR yang telah dielektroforesis dilakukan pengambilan foto dan dianalisis dengan melakukan skoring. Profil pita DNA hasil analisis RAPD diskoring dengan ada atau tidaknya hasil amplifikasi. Jika terdapat pita maka genotipe tersebut dinilai dan jika tidak terdapat pita pada genotipe yang lain dinilai 0. Contoh proses skoring dapat dilihat pada Gambar. Gambar Cara analisis DNA dengan skoring 3.5. Data Analisis Hasil skoring yang diperoleh bertujuan untuk memperoleh nilai untuk menghitung keragaman genetik seluruh populasi dan diferensiasi antar populasi dengan menggunakan program POPGEN 3. Pendugaan hubungan kekerabatan dilakukan berdasarkan jumlah pita polimorfik yang dimiliki bersama (Nei dan Lei 979, diacu dalam Yunanto 006). Analisis pengelompokan berdasarkan metode UPGMA (Unweighted Pair-Group with Aritmatic Average) dengan software NTSYS Versi.0. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) berdasarkan Program GenAlEx. Parameter variasi genetik yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut (Finkeldey 005):. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) = x 00% Keterangan : (LP) : jumlah lokus gen polimorfik (LM) : jumlah lokus gen monomorfik 5

7 . Jumlah alel yang diamati (n e ) = 3. Jumlah alel yang efektif (na) = Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i 4. Heterozigositas harapan = Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i 5. Diferensiasi genetik (Gst) (Nei 973) = Keterangan : Ht : Keragaman genetik total Hs : Keragaman genetik populasi 6