12 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan April 2006 sampai dengan bulan April 2007. Penelitian dilakukan di rumah kaca, laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan laboratorium BIORIN, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al (Anwar et al. 2000). Cekaman dilakukan pada kultur cair dengan menggunakan media kultur menurut Sopandie et al. (1996) yang dimodifikasi Anwar (1999). RNA diisolasi menggunakan kit Trizol (Invitrogen). Primer Gα didesain dari kedelai, yaitu SGAI (nomor aksesi L27418) dengan primer forward (F) terletak pada 111 nukleotida sebelum kodon awal (5 GCTTCACACTTCACACTTAACACT3 ) dan primer reverse (R) terletak pada 114 nukleotida sesudah kodon akhir (5 ATATTGTTGTATACCTGACCTC3 ). Ekspresi gen GST dideteksi dengan menggunakan dua primer yaitu GST8 (nomor aksesi AF243363) dan GST12 (nomor aksesi AF243367). Primer F GST8 terletak pada 11 nukleotida sebelum kodon awal (5 ATAGTGCTGCAATGGCTTCA3 ) dan primer R terletak pada 16 nukleotida sebelum kodon akhir (5 AGATGTGGTGTGTGACTTAG3 ). Primer F gen GST12 terletak pada 2 nukleotida sebelum kodon awal (5 CCATAGCAATGGCAGAGCAAG3 ) dan primer R terletak pada 34 nukleotida sebelum kodon akhir (5 TATATATCATTCTGTGGCAG3 ). Sebagai kontrol untuk mengetahui kemurnian cdna dari kontaminasi DNA genom digunakan primer β-aktin yang didesain dari kedelai (nomor aksesi V00450) dengan primer F tepat pada kodon awal dari ekson 1 (5 ATGGCAGATGCCGAGGATAT3 ) dan primer R tepat pada daerah ekson 2 (5 CAGTTGTGCGACCACTTGCA3 ). Alat utama yang digunakan untuk kultur cair adalah tray, bak, selang, aerator, tong, gelas ukur. Alat untuk isolasi RNA dan PCR adalah sentrifugasi, pipet mikro, Digi doc-it, kamera, alat elektroforesis, mesin PCR (MJ Research).
13 Metode Penelitian Analisis ekspresi gen Gα dan GST dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: (1) Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman, (2) Isolasi RNA total, (3) Sintesis cdna total, dan (4) Analisis ekspresi gen Gα, GST8 dan GST12, seperti pada Gambar 1. Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Isolasi RNA Total Sintesis cdna Total Analisis ekspresi gen Gα, gen GST8, dan GST12 Gambar 1. Tahapan yang dilakukan dalam analisis ekspresi gen Gα dan GST (1) Penentuan Konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Al dilakukan dengan kultur kecambah di lartan hara. Langkah awal dari perlakuan cekaman Al adalah menyeleksi biji kedelai kultivar Lumut yang memiliki ukuran yang sama. Benih yang terpilih dikecambahkan selama dua hari. Benih dikecambahkan dalam kertas merang, disimpan dalam ruang gelap dengan kelembaban yang tinggi. Setelah berkecambah, kecambah dipindahkan ke dalam larutan hara dengan dosis 1/5 dari yang digunakan Sopandie et al. (1996) dengan ph 6 selama 2 hari. Kecambah ditanam di atas tray ukuran 20 cm x 30 cm yang telah dilubangi agar akar dapat masuk. Tray tersebut diletakan di dalam bak plastik ukuran 25 cm x 35 cm x 15 cm yang telah berisi larutan hara ph 6 sebagai media tanamnya. Untuk menjaga ketersediaan oksigen media cair diberi aerasi 4 lubang tiap bak. Posisi tray diatur sedemikian rupa sehingga akar menyentuh media cair. Komposisi media tanam adalah 0.375 mm Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O, 0.2 μm CuSO 4.5H 2 O, 0.25 mm NH 4 NO 3, 1 μm ZnSO 4.7H 2 O, 0.1 mm MgSO 4.7H 2 O, 5 μm H 3 BO 3, 0.1 mm KH 2 PO 4, 1 μm (NH 4 ) 6. Mo 7 O 24.4H 2 O, 5 μm MnSO 4.H 2 O, 5 μm Fe-EDTA.
14 Tahapan pada hari berikutnya adalah pemberian perlakuan ph dan cekaman. Perlakuan cekaman yang diberikan adalah ph 4, ph 4+1.2 mm Al dan ph 4+1.6 mm Al. Perlakuan akan Al diberikan dalam bentuk AlCl 3. Media ph 6 digunakan sebagai kontrol. Perlakuan dilakukan selama 3 x 24 jam, dengan media diganti setiap 24 jam. Pengamatan panjang akar utama dilakukan pada jam ke-0, jam ke-8, jam ke-24, jam ke-48 dan jam ke-72. Pengamatan dilakukan terhadap 10 sampel tanaman yang diambil secara acak, dengan mengukur panjang akar dari pangkal batang sampai dengan ujung akar. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Pada saat pengamatan, ujung akar utama sekitar 0.3 cm diambil, dibungkus dengan aluminium foil lalu difiksasi di dalam nitrogen cair dan disimpan di freezer suhu - 40 C. Pemilihan konsentrasi Al dan lama cekaman yang optimum untuk menghambat pertumbuhan akar ditentukan berdasarkan persentase perpanjangan akar (delta) pada setiap jam perlakuan. Konsentrasi Al dan ph serta lama cekaman yang menghambat pertumbuhan akar digunakan untuk analisis ekspresi gen Gα dan gen GST. Reduksi atau stimulasi perpanjangan akar dihitung berdasarkan nilai perbandingan pertambahan panjang akar dari perlakuan terhadap pertambahan panjang akar dari kontrol dan merupakan nilai rataan dari dua ulangan yang masing-masing terdiri dari 10 tanaman. Kontrol untuk percobaan perlakuan cekaman Al dan ph adalah tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4 sehingga reduksi perpanjangan akar dihitung dengan rumus: RPA = (Yti Yto) (Xti Xto) (Yti Yto) atau RPA = PPAy PPAx PPAy 100 100 Dimana; RPA :Reduksi panjang akar Yti :Panjang akar dari tanaman kontrol ph 4 pada waktu ti Yto :Panjang akar dari tanaman kontrol ph 4 pada waktu to Xti :Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada ph 6, ph 4+1.2 mm Al, ph 4+1.6 mm Al pada waktu ti
15 Xto :Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada ph 6, ph 4+1.2 mm Al, ph 4+1.6 mm Al pada waktu to PPAy :Pertambahan perpanjangan akar tanaman kontrol ph 4 PPAx :Pertambahan perpanjangan akar tanaman perlakuan x Nilai RPA positif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan reduksi pertambahan panjang akar bila dibandingkan dengan kontrol, yaitu tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4. Nilai RPA negatif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan stimulasi pertambahan panjang akar dibandingkan dengan kontrol. (2) Isolasi RNA dengan Metode Trizol Sebanyak 50-100 mg ujung akar kedelai yang telah tersimpan dalam aluminum foil di dalam freezer, diberi nitrogen cair langsung digerus dengan menggunakan mortar sampai halus berbentuk bubuk. Bubuk dicampur dengan 800 μl Trizol (Invitrogen). Suspensi sel dipindahkan ke dalam ependorf, dan diinkubasikan pada suhu ruang selama kurang lebih 5 menit. Ke dalam ependorf tersebut, kloroform (200 μl) dimasukkan dan suspensi sel divortex sampai tercampur. Campuran diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 menit. Selanjutnya ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm (Jouan BR4i) dengan suhu 6 C selama 15 menit. Cairan bagian atas diambil sebanyak minimal 60% dari volume Trizol. Supernatan tersebut dipindahkan ke dalam ependorf baru, dan ditambah dengan isopropil alkohol lalu diinkubasikan dalam suhu ruang selama 10 menit. Setelah itu ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 10 menit dengan suhu 6 C. Supernatan dari hasil sentrifugasi dibuang, dan endapannya diambil, kemudian ditambah dengan etanol 75%. Ependorf kembali disentrifugasi dengan kecepatan 5700 rpm selama 5 menit dengan suhu 6 C. Etanol 75% dibuang, endapan dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering endapan disuspensikan dalam 30 μl H 2 O-DEPC 0.1%. Kuantitas RNA total dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer, absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 (λ 260 ), dan 280 (λ 280 ). Keutuhan RNA total dianalisis secara kualitatif menggunakan metode elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer MOPS 1% (4,2 g/l 3-
16 Morpholinopropanesulfonic acid (C 7 H 15 NO 4 ), 0,41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l Na 2 EDTA.H 2 O). (3) Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST Analisis ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan RT-PCR (Reverse Transcript PCR). Karena mrna mudah terdegradasi, maka mrna diubah menjadi cdna. Keberhasilan sintesis cdna dan kemurniannya dianalisis dengan primer spesifik β-aktin. Sintesis cdna Total Sintesis cdna total melalui transkripsi balik (RT) dilakukan dengan metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 μl buffer (5x), 2 μl 2 mm dntp mix, 2 μl 0.1 M dtt, 2 μl primer oligo(dt), 0.2 μl 0.1 U enzim reverse transcriptase (RT), dan H 2 O-DEPC hingga volume akhir reaksi 20 μl. Kondisi RT adalah 10 menit suhu 30 C, 50 menit suhu 42 C, 5 menit suhu 95 C. Evaluasi keberhasilan sintesis cdna total dilakukan melalui PCR dengan menggunakan primer β-aktin. PCR β-aktin dilakukan dengan mencampur 2 μl cdna total, 2 μl buffer (10x), 1 μl 2 mm dntpmix, 0.8 μl 25 mm MgCl, 0.1 μl 0.1 U enzim taq polimerase, 2 μl 10 pmol primer forward (F), 2 μl 10 pmol primer reverse (R), digenapkan dengan ddh 2 O hingga 20 μl. Kondisi PCR adalah pra-pcr 95 C 5 menit, denaturasi 94 C 30 detik, annealing 56 C 30 detik, ekstensi 72 C 2 menit, siklus diulangi 30 kali, dan pasca-pcr 72 C 5 menit. Apabila cdna yang disintesis adalah murni yang tidak terkontaminasi DNA genom, maka PCR menghasilkan amplifikasi berukuran 450 pb. Apabila terkontaminsi DNA genom, maka produk hasil PCR berukuran 540 pb karena cetakan DNA genom yang diamplifikasi meliputi daerah ekson 1, intron dan ekson 2. Selain untuk melihat keberhasilan sintesis cdna dan kemurnian cdna dari kontaminan DNA genom, PCR β-aktin juga digunakan untuk menyetarakan konsentrasi cdna pada berbagai perlakuan. Untuk mengetahui ukuran PCR β- aktin, dilakukan elektroforesis pada gel agarosa di dalam bufer elektroda TAE 1x (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA).
17 Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST (GST8 dan GST12) dilakukan dengan cara mengamplifikasi gen spesifik tersebut dengan menggunakan cdna sebagai cetakannya. Langkah dalam mencampur bahan untuk PCR gen Gα dan gen GST sama dengan langkah PCR aktin kecuali primer yang disesuaikan dengan gen yang dianalisis. Kondisi PCR gen Gα adalah pra-pcr 95 C 5 menit, denaturasi 94 C 30 detik, penempelan primer 56 C 30 detik, ekstensi 72 C 2 menit, siklus diulang sebanyak 30 kali, dan pasca-pcr 72 C 5 menit. Kondisi PCR gen GST (GST8 dan GST12) sama dengan gen Gα, hanya suhu penempelan primernya dilakukan pada suhu 52 C 30 detik. Analisis ekspresi dilakukan dengan membandingkan intensitas cahaya pita hasil PCR gen Gα dan GST terhadap kontrol β-aktin dengan menggunakan perangkat lunak Digi Doc-it. Agar dapat diperbandingkan ekspresi antar gen sasaran pada waktu yang sama pada berbagai perlakuan, maka ekspresi gen sasaran harus dibakukan. Pembakuan ekspresi gen sasaran dilakukan dengan membandingkan ekspresi gen sasaran dengan gen aktin pada waktu dan perlakuan yang sama. Ekspresi gen yang dibakukan merupakan nilai rataan dari dua ulangan. Oleh sebab itu ekspresi gen sasaran Gα, gen GST 8 atau gen GST12 dibakukan dengan menggunakan rumus : EBXpt = IXpt IApt Dimana; EBXpt: Ekspresi baku gen x pada perlakuan p waktu t IXpt : Intensitas hasil PCR gen x pada perlakuan p waktu t IApt : Intensitas hasil PCR β-aktin pada perlakuan p waktu t X : Gα, GST8 atau GST12 A : Aktin t : 0, 8, 24, 48, atau 72 jam perlakuan cekaman