III. METODOLOGI PENELITIAN A. Alat dan Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah teh hijau yang diperoleh dari PT Perkebunan Nusantara Gunung Mas di Bogor. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis daya inhibisi enzim alfa-amilase antara lain: pati murni (Merck), enzim alfa-amilase pancreatic porcine (Sigma A3176), pereaksi asam 3,5 dinitrosalisilat (DNS), larutan stok maltosa standar, dan buffer natrium fosfat ph 6.9. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur kadar tanin antara lain : aquades, HCl 32%, dan formalin (HCHO) 27%. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis daya inhibisi enzim alfa-glukosidase antara lain: enzim alfa-glukosidase dari Saccharomyces cerevisiae tipe I (Sigma G5003), larutan p-nitrofenil-α-d glukofuranosida (Sigma N1377), buffer kalium fosfat ph 6.8, dan Na 2 CO 3. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur total fenol adalah etanol 95%, pereaksi Folin Ciocalteau 50%, Na 2 CO 3 5%, dan larutan asam galat. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer, sentrifugasi, neraca analitik, gelas piala, tabung reaksi, tabung reaksi bertutup, kuvet, alat vortex, pipet, penangas air, gelas ukur, neraca analitik, alumunium foil, termometer, inkubator, sudip, gelas pengaduk, gelas arloji, dan saringan, sikat. B. Metode Penelitian Tahap penelitian dilakukan seperti pada Gambar 3. Penelitian pertama-tama dilakukan dengan menyeduh bubuk teh hijau dengan menggunakan suhu air dan lama penyeduhan yang berbeda. Ekstrak teh hijau yang didapat dari penyeduhan kemudian diberi dua perlakuan yang berbeda, yaitu ada yang diberi perlakuan pengaturan simulasi ph pencernaan dan ada yang tanpa diberi perlakuan (disebut ekstrak awal). Ekstrak yang dibiarkan seperti ekstrak awal langsung dilakukan beberapa uji, yaitu pengukuran ph, inhibisi enzim alfa amilase, inhibisi enzim alfa glukosidase, total fenol, dan kadar tanin. Ekstrak awal yang diberi pengaturan simulasi ph pencernaan pertama-tama diubah ph nya seperti ph lambung (ph 2) dan didiamkan selama 30 menit kemudian dinaikkan menjadi ph 6.8 seperti ph pada usus halus. Ekstrak tersebut diuji daya inhibisinya terhadap enzim alfa amilase dan alfa glukosidase. 1. Ekstraksi Sampel teh yang digunakan merupakan sampel yang didapat langsung dari industri pengolahan teh sehingga diharapkan teh ini masih memiliki kualitas yang baik karena tidak melalui proses distribusi yang panjang atau penyimpanan yang terlalu lama. Teh hijau yang diuji memiliki konsentrasi yang sama, yaitu 0.04 g/ml (4 gram teh ditambahkan dengan 100 ml air). Teh hijau diuji berdasarkan perbedaan suhu dan lamanya waktu menyeduh teh. Teh hijau diuji dengan perbedaan suhu yaitu sebesar 70 o dan 100 o C dan juga perbedaan waktu yaitu sebesar 5, 15, dan 30 menit. Diagram alir ekstraksi teh dapat dilihat pada Lampiran 1. 2. Perlakuan ph Simulasi Sistem Pencernaan Pada percobaan ini, kondisi keasaman ekstrak teh hijau yang digunakan adalah pada ph awal produk dan pada ph usus halus. Ekstrak teh hijau pertama-tama diukur ph-nya sehingga didapatkan ph ekstrak awal. Penepatan ph usus halus ini dilakukan dengan terlebih dahulu menepatkan ph menjadi 2 dengan menggunakan kurang lebih tiga sampai empat tetes HCl 11.96 N dan ditunggu kurang lebih tiga puluh menit dan kemudian ph ditepatkan kembali menjadi 6,8-7
dengan menggunakan NaOH 10 N sebanyak lima sampai tujuh tetes. sehingga didapatkan kondisi keasaman seperti keadaan ph usus halus manusia. Kondisi ini dilakukan agar dapat menyerupai kondisi pencernaan manusia pada umumnya. Teh Hijau Ekstraksi (penyeduhan 4 gram teh hijau dalam 100 ml air pada suhu awal 70 o C dan 100 o C selama 5, 15, dan 30 menit) Ekstrak Teh Hijau Pengaturan simulasi ph pencernaan (ph 2 selama 30 menit kemudian ph 6.8) Pengukuran ph Pengukuran inhibisi alfa amilase Pengukuran inhibisi alfa glukosidase Pengukuran total fenol Pengukuran kadar tanin Pengukuran inhibisi alfa amilase Pengukuran inhibisi alfa glukosidase Gambar 3. Diagram alir penelitian 3. Pengujian Pengujian daya inhibisi enzim alfa-amilase dan alfa-glukosidase yang dilakukan baik pada ekstrak dengan ph awal maupun ph usus halus (6.8) setelah melalui ph lambung (ph 2) selama 30 menit. Kadar total fenol, ph (dengan menggunakan ph-meter), dan kadar tanin juga diukur pada ekstrak awal. A) Pengujian inhibisi enzim alfa-amilase (Thalapaneni et al. 2008) Pada penelitian ini ingin diketahui pengaruh masing-masing konsentrasi teh hijau terhadap penurunan aktivitas enzim alfa amilase dalam memecah pati sehingga hasilnya adalah penurunan daya cerna pati.enzim alfa amilase akan menghidrolisis pati menjadi gula-gula 11
sederhana. Semakin banyak gula-gula sederhana seperti glukosa dan maltosa yang dihasilkan dari proses hidrolisis pati, hal ini menggambarkan semakin tingginya daya cerna pati. Glukosa dan maltosa dapat bereaksi dengan DNS (asam dinitrosalisilat) sehingga kadar keduanya dapat diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 540 nm. B) Pengujian inhibisi enzim alfa-glukosidase (Mayur et al. 2010) Pada penelitian ini enzim alfa-glukosidase yang digunakan berasal Saccharomyces cerevisiae tipe I. Aktifitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dilakukan secara in vitro dengan melihat pemecahan substrat p-nitrofenil-α-d-glukofiranosa menjadi p-nitrofenil yang berwarna kuning dan glukosa. Aktifitas penghambatan enzim diukur berdasrkan jumlah p- nitrofenil yang dihasilkan dengan mengukur nilai absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. C) Pengujian kadar total fenol (Strycharz dan Shetty 2002 dengan modifikasi diacu Zega 2010) Analisis kadar total fenol dilakukan dengan menggunakan reagen folin-ciocelteau. Pengukuran dilakukan dengan cara melihat kemampuan reduksi dari komponen fenol dengan standar yang digunakan adalah asam galat. Prinsip dari metode ini adalah reduksi dari reagen fosfomolibdat (MoO 4 2- ) dan fosfotungstat (WO 4 2- ) sehingga terbentuk kompleks warna biru yang dapat terukur secara spektrofotometri sinar tampak. Pengukuran dilkukan pada panjang gelombang 725 nm. D) Pengukuran kadar tanin (Nugraha 1999) Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui kadar tanin yang ada pada sampel, yaitu ekstrak teh hijau. Pengukuran kadar tanin ini di lakukan dengan metode gravimetri. Menurut Ummah (2010) reaksi yang terjadi didasarkan pada kereaktifan struktur flavonoid dari tanin terkondensasi terhadap formaldehida. Hasil dari reaksi ini akan membentuk endapan sehingga secara kualitatif dapat diketahui adanya tanin terkondensasi. E) Analisis 1. Inhibisi Enzim Alfa Amilase (Thalapaneni et al. 2008) Larutan enzim α-amilase yang digunakan adalah enzim porcine pancreatic amylase 1 unit/ml. Reagen yang digunakan adalah buffer natrium fosfat 20 mm dengan penambahan natrium klorida 6,7 mm yang ditepatkan ph nya sampai 6,9 menggunakan NaOH 1M. Larutan substrat yang digunakan adalah larutan pati soluble 1%. Reagen warna dibuat dengan mencampurkan larutan natrium kalium tartarat dengan larutan asam 3,5-dinitrosalisilat 96 mm yang diencerkan dengan akuades. Campuran reaksi diperoleh dengan melarutkan 125 µl larutan teh hijau dan 125 µl larutan enzim. Setelah campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit, larutan pati ditambahkan sebanyak 125 µl dan diinkubasi kembali pada suhu 37 o C selama 10 menit. Setelah inkubasi kedua, pereaksi DNS ditambahkan sebanyak 500 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada air mendidih. Setelah itu, 5 ml air suling ditambahkan dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. positif yang digunakan pada penelitian ini adalah acarbose 0.5 mg/ml yang diperoleh dari pelarutan 1 tablet glukobay (50 mg acarbose) dalam 100 ml HCl 2 N. Tabel 1. menunjukkan kombinasi jumlah sampel, buffer 12
fosfat, dan enzim yang diberikan pada balnko, kontrol A, kontrol B, sampel serta acarbose sebagai kontrol positif. Blanko digunakan untuk mengukur jumlah gula awal yang telah terdapat pada pati, sedangkan kontrol A digunakan untuk mengukur jumlah gula yang telah terhidrolisis pada pati. B digunakan untuk mengukur jumlah gula awal pada sampel dan pati, sedangkan sampel digunakan untuk menghitung jumlah gula yang telah terhidrolisis pada sampel dan pati. Larutan Tabel 6. Jumlah larutan pada analisis aktivitas inhibisi alfa-amilase Blanko A B Sampel Sampel - - 125 125 Buffer fosfat 250 125 125 - Enzim - 125-125 Pati 125 125 125 125 Pereaksi DNS Air suling 500 500 500 500 5000 5000 5000 5000 Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: A1 A2 % inhibisi = X 100% A1 Keterangan : A1 = Absorbansi kontrol A Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel Absorbansi B 2. Inhibisi Enzim Alfa Glukosidase (Mayur et al. 2010) Enzim α-glukosidase yang digunakan berasal Saccharomyces cerevisiae tipe I dengan aktivitas 0,2 unit/ml. Buffer yang digunakan adalah buffer kalium monobasic anhydrous 100 mm yang ditepatkan ph nya sampai 6,8 dengan 1 M NaOH. Substrat yang digunakan adalah larutan p-nitrofenil-α-d-glukofiranosida 0,5 mm. Aktivitas enzim dihentikan dengan larutan Na 2 CO 3 0,2 M. Campuran reaksi diperoleh dengan melarutkan 140 µl larutan sampel dan 350 µl larutan enzim. Setelah campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit, substrat berupa larutan p-nitrofenil-α-d-glukofiranosida ditambahkan sebanyak 350 µl dan diinkubasi kembali pada suhu 37 o C selama 30 menit. Setelah inkubasi kedua, tambahkan 1400 µl larutan Na 2 CO 3 0,2 M. Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 410 nm. positif yang digunakan pada penelitian ini adalah acarbose 0.5 mg/ml yang diperoleh dari pelarutan 1 tablet glukobay (50 mg acarbose) dalam 100 ml HCl 2 N. Tabel 6, menunjukkan kombinasi jumlah sampel, buffer fosfat, dan enzim yang diberikan pada balnko, kontrol A, kontrol B, sampel serta acarbose sebagai kontrol positif. Blanko digunakan untuk mengukur jumlah gula awal yang telah terdapat pada substrat, sedangkan kontrol A digunakan untuk mengukur jumlah gula yang telah terhidrolisis pada substrat. B digunakan untuk mengukur jumlah gula awal pada sampel dan substrat, 13
sedangkan sampel digunakan untuk menghitung jumlah gula yang telah terhidrolisis pada sampel dan substrat. Tabel 7. Jumlah larutan pada analisis aktivitas inhibisi alfa-glukosidase Larutan Blanko A B Sampel Sampel - - 140 140 Buffer 1190 840 1050 700 Enzim - 350-350 Substrat p- nitrofenil-α-dglukofiranosida 350 350 350 350 Na 2 CO 3 1400 1400 1400 1400 Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: A1 A2 % inhibisi = X 100% A1 Keterangan : A1 = Absorbansi kontrol A Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel Absorbansi kontrol B 3. Penentuan Kadar Tanin (Nugraha 1999) Ekstrak sampel sebanyak 25 ml ditambahkan HCl 32 % sebanyak 5 ml dan sebanyak 10 ml formalin (HCHO) 27%, setelah itu dipanaskan diatas refluks selama 30 menit. Larutan hasil refluks kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring yang telah diketahui beratnya dan dicuci dengan aquades sampai bebas asam. Endapan yang terbentuk dikeringkan pada suhu 100 O C selama 24 jam, kemudian ditimbang. Kandungan tanin dari ekstrak bisa dihitung dengan rumus : Kadar tanin = 100 4. Total Fenol (Strycharz dan Shetty 2002 dengan modifikasi diacu Zega 2010) Larutan standar asam galat dibuat pada berbagai konsentrasi, yaitu 50, 100, 150, 200, dan 250 ppm. Pengujian ini menggunakan reagen folin ciocalteau 50% dan pereaksi Na 2 CO 3 5%. Pertama-tama, larutan standar atau sampel sebanyak 0.5 ml dilarutkan dalam 0.5 ml etanol 95%, 2.5 ml air suling dan 2.5 ml larutan reagen folin ciocalteau. Setelah itu larutan didiamkan selama 5 menit dalam ruang gelap dan kemudian ditambahkan 0.5 ml larutan Na 2 CO 3 dan diinkubasi kembali dalam ruang gelap selama 1 jam. Setelah inkubasi, larutan di vorteks dan diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 725 nm. 14
5. Analisis Statistik Data-data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan dua faktorial RAL. Faktor-faktor yang dianalisis adalah faktor waktu, faktor suhu, dan faktor interaksi keduanya. Untuk melihat faktor interaksi suhu dan waktu acarbose dijadikan kontrol positif. Jika perlakuan memberikan pengaruh nyata, maka pengujian dilanjutkan dengan analisis lanjut Duncan dengan taraf nyata 5% untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Untuk menguji pengaruh perbedaan ph terhadap nilai inhibisi, maka uji T-test dua berpasangan. 15