III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian - The Netherlands) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Penelitian dimulai dari bulan Januari 2005 sampai dengan bulan Januari 2007. Bahan Bahan tanaman yang digunakan adalah kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman aluminium (Anwar et al. 1999). Cekaman Al menggunakan AlCl 3. Primer forward (F) (5 CCCAAGCTTGGTACCCGCGTCTGTTGACTGGCAGG3 ) dan Primer reverse (R) (5 CCCTCTAGACTCGAGTGGAGATGGTGCTGTTGGTCC3 ) digunakan untuk amplifikasi cdna dari gen penyandi peroksidase. Primer (F) terletak pada 111 nukleotida sebelum kodon awal (5 GCTTCACACTTCACACTTAACACT3 ) dan primer (R) terletak pada 114 nukleotida sesudah kodon akhir (5 ATATTGTTGTATACCTGACCTC3 ) yang didesain dari kedelai, yaitu SGAI (nomor aksesi L27418), digunakan untuk amplifikasi cdna dari gen penyandi Gα. Primer F tepat pada kodon awal dari ekson 1 (5 ATGGCAGATGCCGAGGATAT3 ) dan primer R tepat pada daerah ekson 2 (5 CAGTTGTGCGACCACTTGCA3 ), didesain dari kedelai (nomor aksesi V00450), digunakan untuk amplifikasi β-aktin Metode Penelitian Analisis ekspresi gen Gα dan PER dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: (1) Perlakuan cekaman pada kultur cair, (2) Isolasi RNA total, (3) Sintesis cdna total, dan (4) Analisis ekspresi gen Gα dan PER. (1) Perlakuan cekaman Al pada kultur cair Langkah awal adalah menyeleksi biji kedelai kultivar Lumut yang memiliki ukuran yang sama kemudian benih dikecambahkan selama dua hari. Benih dikecambahkan dalam kertas merang, disimpan dalam ruang gelap dengan kelembaban yang tinggi. Setelah berkecambah, kecambah ditanam di atas wadah 13
ukuran 20 cm x 30 cm yang berlubang. Wadah tersebut diletakkan di atas bak plastik ukuran 25 cm x 35 cm x 15 cm yang telah berisi media cair ph 6 sebagai media tanamnya, dan diberi aerasi dengan menempatkan aerator sebanyak 4 buah tiap wadah untuk menjaga ketersediaan oksigen. Kecambah diletakkan sedemikian rupa sehingga ujung akar menyentuh media cair. Komposisi media tanam adalah 0.375 mm Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O, 0.2 µm CuSO 4.5H 2 O, 0.25 mm NH 4 NO 3, 1 µm ZnSO 4.7H 2 O, 0.1 mm Mg SO 4. 7H 2 O, 5 µm H 3 BO 3, 0.1mM KH 2 PO 4, 1 µm (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24.4H 2 O, 5 µm MnSO 4.H 2 O, 5 µm Fe-EDTA, dengan ph 6 (Anwar 2000). Kecambah ditumbuhkan pada media ini selama 2 hari Tahapan pada hari berikutnya adalah pemberian perlakuan. Perlakuan yang diberikan ada dua macam yaitu perlakuan ph dan perlakuan Al. Bak pertama digunakan untuk ph 6 yang merupakan kontrol perlakuan ph, bak kedua untuk ph 4. Bak kedua yang berisi media dengan ph 4 juga digunakan sebagai kontrol perlakuan Al. Bak ketiga untuk perlakuan ph 4 dengan cekaman 1,2 mm Al dan bak keempat untuk perlakuan ph 4 dengan cekaman 1,6 mm Al. Perlakuan dilakukan selama 3x24 jam, dengan media diganti setiap 24 jam. Pengamatan panjang akar utama dilakukan terhadap 10 sampel yang diambil secara acak, dengan mengukur akar dari pangkal batang sampai dengan ujung akar. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Pada saat pengamatan, sekitar 0,3 cm ujung akar utama diambil, dibungkus dengan aluminium foil lalu difiksasi di dalam nitrogen cair dan disimpan di freezer suhu -40 C. Bahan tanaman ini nantinya digunakan untuk isolasi RNA total. Pemilihan konsentrasi Al yang optimum dan lama cekaman ditentukan berdasarkan persentase selisih perpanjangan akar pada setiap jam perlakuan. Konsentrasi Al dan ph serta lama cekaman yang optimum menghambat pertumbuhan akar digunakan untuk uji ekspresi gen Gα dan gen PER. Reduksi atau stimulasi perpanjangan akar dihitung berdasarkan nilai perbandingan pertambahan panjang akar dari perlakuan terhadap pertambahan panjang akar dari kontrol. Kontrol pada percobaan ini adalah tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4,0 untuk perlakuan Al dan ph 6 sebagai kontrol perlakuan ph. Reduksi perpanjangan akar dihitung dengan rumus: ( Yti Yto ) ( Xti Xto ) = ( Yti Yto ) 100 14
atau = PPAy PPAx PPAy 100 Yti Yto Xti Xto PPAy PPAx : Reduksi panjang akar : Panjang akar dari tanaman kontrol pada waktu ti : Panjang akar dari tanaman kontrol pada waktu to : Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada waktu ti : Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada waktu to : Pertambahan panjang akar tanaman kontrol : Pertambahan panjang akar tanaman perlakuan Nilai positif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan reduksi pertambahan panjang akar bila dibandingkan dengan kontrol, yaitu tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4,0. Nilai negatif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan stimulasi pertambahan panjang akar dibandingkan dengan kontrol. (2) Isolasi RNA total Sekitar 50-100 mg ujung akar kedelai yang telah tersimpan dalam aluminum foil pada suhu -40 0 C, diberi nitrogen cair langsung digerus dengan menggunakan mortar sampai halus berbentuk bubuk. Bubuk dicampurkan 800 µl TRIzol. Suspensi sel dipindahkan ke dalam ependorf dan diinkubasikan pada suhu ruang selama kurang lebih 5 menit. Ke dalam ependorf, 200 µl kloroform dimasukkan dan suspensi sel divortex sampai tercampur. Campuran diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 menit. Selanjutnya ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm (Jouan BR4i) dengan suhu 6 C selama 15 menit. Cairan bagian atas diambil sebanyak minimal 60% dari volume TRIzol. Supernatan tersebut dipindahkan ke dalam ependorf baru, dan ditambahkan isopropil alkohol lalu diinkubasikan dalam suhu ruang selama 10 menit. Setelah itu ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 10 menit dengan suhu 6 C. Supernatan dari hasil sentrifugasi dibuang, dan endapannya diambil. Kemudian ditambah dengan etanol 75% lalu divortex. Ependorf kembali disentrifugasi dengan kecepatan 5700 rpm selama 5 menit dengan suhu 6 C. Etanol 75% dibuang, endapan dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering endapan disuspensikan dalam 30 µl DEPC 0.1% ( v / v ). 15
(3) Sintesis cdna Total Sintesis cdna dilakukan dengan transkripsi balik menggunakan RNA total sebagai cetakan dengan metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 µl buffer (5x), 2 µl 2 mm dntpmix, 2 µl 0.1 M dtt, 10 pmol primer oligo dt, 1 unit enzim reverse transcriptase (RT) dan DEPC hingga volume akhir reaksi 20 µl. Kondisi reaksi transkripsi balik adalah 10 menit suhu 30 C, 50 menit suhu 42 C, 5 menit suhu 95 C. Evaluasi keberhasilan sintesis cdna total dilakukan melalui PCR dengan menggunakan primer β-aktin. PCR β-aktin dilakukan dengan mencampur 2 µl cdna total, 2 µl buffer (10x), 1 µl 2 mm dntpmix, 0,8 µl 25 mm MgCl 2, 1unit enzim taq DNA polimerase, 10 pmol primer aktin forward (F), 10 pmol primer aktin reverse (R), 0,4 µl DMSO digenapkan dengan ddh 2 O hingga 20 µl. Kondisi yang digunakan adalah Pra-PCR 95 C 5 menit, denaturasi 94 C 30 detik, annealing 55 C 30 detik, ekstensi 72 C 1 menit 40 detik, siklus diulangi sebanyak 30 kali, pasca-pcr 72 C 5 menit. Apabila cdna yang disintesis adalah murni yang tidak terkontaminasi DNA genom, PCR menghasilkan amplifikasi berukuran 450 pb. Apabila terkontaminsi DNA genom, maka hasil PCR berukuran 450 pb dan 550 pb karena cetakan cdna menghasilkan 450 pb dan cetakan DNA genom menghasilkan 550 pb yang meliputi daerah ekson 1, intron dan ekson 2. Selain untuk melihat keberhasilan sintesis cdna total dari kontaminasi DNA genom, PCR β-aktin juga digunakan untuk menyetarakan konsentrasi cdna pada berbagai perlakuan. Untuk mengetahui ukuran PCR aktin, dilakukan elektroforesis pada gel agarosa TAE 1x (0,04 M Tris-acetat, 0,001 M EDTA). (4) Ekspresi gen Gα dan gen PER Analisis ekspresi gen dilakukan pada tanaman kedelai yang mendapat perlakuan ph dan perlakuan Al secara terpisah. Perlakuan ph yang diberikan adalah ph 4 dan ph 6 sebagai kontrol. Perlakuan Al menggunakan ph 4 tanpa penambahan Al sebagai kontrol. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Analisis ekspresi gen Gα dan gen PER dilakukan dengan cara mengamplifikasi gen spesifik tersebut dengan menggunakan cdna total sebagai cetakannya. Langkah dalam mencampur bahan untuk PCR gen Gα dan gen PER sama dengan PCR aktin, 16
yang membedakan hanya primer yang disesuaikan dengan gen yang dianalisis. Kondisi PCR gen Gα sama dengan kondisi PCR aktin, sedangkan untuk kondisi PCR gen PER yaitu Pra-PCR 94 C 2 menit, denaturasi 92 C selama 30 detik, annealing/penempelan 55 C selama 30 detik, ekstensi 75 C selama 1 menit, siklus diulang sebanyak 30 kali, dan pasca PCR 72 C selama 5 menit. Analisis ekspresi dilakukan dengan membandingkan intensitas cahaya pita hasil PCR gen Gα dan PER terhadap kontrol aktin dengan menggunakan perangkat lunak Digi Doc-it. Agar dapat diperbandingkan ekspresi gen sasaran tertentu pada waktu yang sama pada berbagai perlakuan, maka ekspresi gen sasaran tertentu harus dibakukan. Pembakuan ekspresi gen sasaran tertentu dilakukan dengan membandingkan ekspresi gen sasaran dengan gen aktin pada waktu dan perlakuan yang sama. Oleh sebab itu ekspresi gen sasaran Gα, dan gen PER dibakukan dengan menggunakan rumus : EBXpt = IXpt IApt EBX pt : Ekspresi baku gen x pada perlakuan p waktu t IXpt : Intensitas hasil PCR gen x pada perlakuan p waktu t IApt : Intensitas hasil PCR gen aktin pada perlakuan p waktu t x : Gα dan PER t : 0, 8, 24, 48, atau 72 jam perlakuan cekaman 17