62 BAB V. KESIMPULAN, SARANDAN RINGKASAN V. 1. KESIMPULAN Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Tidak ada perbedaan kadar TNF-α antara kelompok yang diberikan ekstrak etanol pegagan dengan kelompok kontrol stres. 2. Tidak ada perbedaan kadar IL-10 antara kelompok yang diberikan ekstrak etanol pegagan dengan kelompok kontrol stres. V. 2. SARAN 1. Bila akan melakukan penelitian untuk mengetahui kadar sitokin IL-10 perlu dipertimbangkan untuk memeriksa kadar sitokin lain seperti IL-1β dan juga hormon-hormon yang berpengaruh terhadap stres seperti hormon glukokortikoid. 2. Pada penelitian selanjutnya mungkin perlu dipertimbangkan untuk meningkatkan dosis dan juga pemberian ekstrak etanol pegagan dengan jangka waktu yang lebih lama setelah perlakuan stres. 3. Pada penelitian selanjutnya perlu dipertimbangkan untuk memeriksa faktor transkripsi NF-κB yang diduga mendasari mekanisme kerja pegagan sebagai antiinflamasi dan juga mekanisme lain misalnya dengan penghambatan aktivasi reseptor N-methyl-D-aspartate (NMDA) pada sel neuron di hippocampus.
63 V.3. RINGKASAN Latar Belakang Stres dapat menghasilkan berbagai perubahan neurokimia, neurotransmiter dan hormonal. Penelitian yang dilakukan menggunakan beberapa protokol stres baik secara fisik, psikologik maupun campuran keduanya menunjukkan adanya respon proinflamatorik di otak dan sistem lain terutama ditandai dengan pengeluaran beberapa mediator inflamasi (Garciá et al., 2008). Organ yang berperan penting dalam respon terhadap stres adalah hippocampus. Hippocampus merupakan bagian dari sistem limbik yang berperan penting dalam mengatur emosi, seperti rasa senang, nyeri, kepatuhan, ketakutan dan marah. Hippocampus juga terlibat dalam memori dan penciuman (Tortora & Derrickson, 2009). Proses inflamasi akibat stres kronis melibatkan peran mikroglia pada patogenesisnya (Czeh et al., 2011). Mikroglia dapat berkembang menjadi fenotip M1 yang bersifat proinflammatorik dan fenotip M2 yang bersifat anti inflamatorik.. Mikroglia M1 yang teraktivasi akan mengeluarkan substansi seperti Reactive oxygen spesies (ROS) dan sitokin proinflamasi seperti interleukin-1β (IL-1β) dan tumor necrosis factor-α (TNF-α) serta matrix metalloproteinase (MMP) dan glutamat. ROS seperti superoxide, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), nitric oxide(no) tidak hanya dapat membunuh mikroba yang menginvasi tapi juga dapat menyebabkan kerusakan neuron dan mikrogliosis reaktif (Block et al., 2007). Mikroglia M2 mempunyai fungsi protektif penting dengan menghilangkan sel yang rusak, mengaktifkan neurogenesis, menginduksi pembentukan kembali
64 lingkungan neuron fungsional dengan memperbaiki selubung mielin. Selain itu, mikroglia juga berperan dalam pelepasan faktor neurotropik serta molekul dan sitokin antiinflamasi seperti interleukin-10 (IL-10) yang dapat menghambat apoptosis mikroglia dan transforming growth factorbeta (TGF-β) yang berfungsi sebagai neuroprotektif (Czeh et al., 2011). Berdasarkan beberapa penelitian dilaporkan bahwa terjadi variasi dalam peningkatan atau penurunan sitokin proinflamasi maupun antiinflamasi pada hewan coba yang diinduksi protokol stres. Salah satu sitokin proinflamasi yang terpengaruh dengan adanya stres adalah TNF-α. Beberapa dekade yang lalu TNFα diidentifikasi sebagai produk dari limfosit dan makrofag yang dapat menyebabkan lisis dari sel tertentu. TNF-α berperan dalam terjadinya beberapa penyakit pada manusia (Locksley et al., 2001). Sebuah penelitian melaporkan bahwa terjadi peningkatan kadar mrna TNF-α yang diinduksi lipopolisakarida pada hippocampus mencit yang mengalami stres prenatal (Chaves et al., 2012). Sedangkan salah satu sitokin antiinflamasi yang terpengaruh dengan adanya stres adalah IL-10. Menurut penelitian yang dilakukan Voorhees et al., (2013), terjadi penurunan sitokin antiinflamasi IL-10 baik pada serum maupun hippocampus mencit yang diinduksi chronic restraint stres (CRS). Pada saat ini, penelitian yang berfokus pada tanaman herbal berkembang luas di dunia. Salah satu tanaman herbal yang banyak digunakan dalam penelitian adalah pegagan (Centella asiatica). Pegagan merupakan tanaman herbal yang cukup penting dan digunakan secara luas di negara timur dan menjadi popular di barat (Gohil et al., 2010). Pegagan selain mempunyai efek neuroprotektif juga diketahui mempunyai efek anti inflamasi(huang et al., 2011).
65 Perumusan Masalah Masih belum diketahui apakah pemberian ekstrak etanol pegagan dapat mempengaruhi kadar sitokin proinflamasi TNF-α dan sitokin antiinflamasi IL-10 di hippocampus tikus pascastres listrik 28 hari. Berdasarkan hal tersebut, maka dalam penelitian ini dirumuskan permasalahan apakah pemberian ekstrak etanol pegagan dapat mempengaruhi kadar sitokin proinflamasi TNF-α dan sitokin antiinflamasi IL-10 di hippocampus tikus pascastres listrik 28 hari? Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakahpemberian ekstrak etanol pegagan dapat mempengaruhi kadar sitokin proinflamasi TNF-α dan sitokin antiinflamasi IL-10 di hippocampus tikus pascastres listrik 28 hari. Landasan Teori Adanya respon proinflamatorik di otak dan sistem lain terutamaditandai dengan pengeluaran beberapa mediator inflamasi (Garciá et al., 2008). Stres kronis ternyata melibatkan peran mikroglia pada patogenesisnya (Czeh et al., 2011). Mikroglia yang teraktifkan dapat berkembang menjadi fenotip M1 yang bersifat proinflammatorik dan fenotip M2 yang bersifat antiinflamatorik. M1 yang teraktivasi akan mengeluarkan substansi seperti ROS dan sitokin proinflamasi seperti IL-1β dan TNF-αyang dapat membunuh mikroba yang menginvasi serta dapat juga menyebabkan kerusakan neuron dan gliosis reaktif (Block et al., 2007). M2 mempunyai fungsi protektif penting dengan menghilangkan sel yang rusak, mengaktifkan neurogenesis, menginduksi pembentukan kembali lingkungan neuron fungsional dengan memperbaiki selubung mielin, dan dengan pelepasan
66 faktor neurotropik serta molekul dan sitokin antiinflamasi seperti IL-10 dan TGFβ yang berfungsi sebagai neuroprotektif (Czeh et al., 2011). Pada stres kronis diketahui terjadi kecenderungan peningkatan sitokin proinflamasi dan penurunan sitokin antiinflamasi di hippocampus tikus. Pegagan selain mempunyai efek neuroprotektif juga diketahui mempunyai efek antiinflamasi (Huang et al., 2011; Sharma & Thakur, 2011). Metode Penelitian Hewan Coba Subjek penelitian yang digunakan adalah tikus jantan galur Sprague Dawley umur 1 bulan dengan berat badan sekitar 100 gram yang dikandangkan secara berkelompok. Tiap kandang berisi dua sampai tiga ekor tikus. Tikus ini diberi air minum dan pakan ad libitum. Kondisi ruangan diharapkan bertemperatur 21 0 C dengan kelembaban 50-60%, siklus gelap-terang 12:12 jam. Tiga puluh ekor tikus yang diuji dalam penelitian ini dikelompokkan secara acak ke dalam 6 kelompok (1 kelompok @ 5 tikus) perlakuan sebagai berikut:kelompok A (tanpa stres + aquades); kelompok B (stres + aquades), kelompok C (tanpa stres + pegagan dosis 300 mg/kgbb), kelompok D (stres + pegagan dosis 150mg/kgBB), kelompok E (stres + pegagan dosis 300 mg/kgbb) dan kelompok F (stres +pegagan dosis 600 mg/kgbb). Ekstrak etanol pegagan Pegagan mentah yang digunakan dalam penelitian ini dibeli di CV. Merapi Farma Herbal, Kaliurang, Sleman, Yogyakarta. Selanjutnya dilakukan determinasi Pegagan untuk memastikan bahwa tanaman yang dibeli memang benar Pegagan
67 (Centella asiatica). Ekstrak etanol Pegagan dibuat dengan metode maserasi di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM. Paradigma stres Stres pada tikus diinduksi menggunakan alat stres listrik. Alat ini berbentuk kotak (plexiglas shock box), tertutup, berukuran panjang 48 cm, lebar 24 cm, dan tinggi 32 cm yang dilengkapi dengan suatu wired grid floor (Persoons, et al., 1995). Pada bagian tengah kotak terdapat suatu sekat yang di tengahnya terdapat pintu terbuka dengan lebar pintu 8 cm dan tinggi 10 cm. Pada ruang bagian sebelah kiri dan kanan sekat dipasang suatu photoelectric cell yang terletak 2 cm di atas electric grid floor. Kotak ini dihubungkan dengan amperemeter untuk mengukur arus listrik, voltmeter untuk mengukur tegangan listrik dan stabilizer untuk menstabilkan tegangan listrik serta dilengkapi alat penghitung jumlah lintasan. Stres listrik tersebut diperlakukan kepada hewan coba dengan ketentuan sebagai berikut : arus yang diberikan sebesar 0,8 ma, selama total perlakuan 10 menit, dengan pemberian stres secara teratur yaitu setiap 15 detik diberikan aliran listrik selama 5 detik (3 kali per menit, 5 detik per pemberian stres). Isolasi dan pengambilan jaringan hippocampus Pada hari ke 28, hewan coba didekapitasi untuk diambil jaringan hippocampusnya setelah sesi perlakuan terakhir selesai dilakukan. Hippocampus kemudian diisolasi proteinnya untuk digunakan dalam pemeriksaan kadar TNF-α dan IL-10 dengan ELISA. Ekstraksi protein dari hippocampus dilakukan menggunakan PRO-PREP Protein Extraction Solution kit(intron cat no 17081).
68 Pemeriksaan konsentrasi protein TNF-α dan IL-10pada jaringan hippocampus tikus dengan metode ELISA Kadar TNF-α dan IL-10 diperiksa menggunakan Rat Tumor-Necrosis Factor-α ELISA-Kit for cell and tissue lysates (Sigma RAB0480-1KT) dan Rat IL-10 ELISA Kit for cell and tissue lysates (Sigma RAB0247-1KT). Prosedur pengukuran konsentrasi TNF-α dan IL-10 dilakukan sesuai dengan protokol dari produsen. Data kadar TNF-α dan IL-10 menggunakan metode immunoassay semikuantitatif berupa konsentrasi TNF-α dan IL-10 yang sudah dikonversi dari O.D. absorbansi menggunakan kurva standard. Tiap sampel diperiksa sebanyak 2 kali dan hasilnya dilaporkan sebagai rerata ± SE. Analisis Statistik Data diuji normalitasnya menggunakan uji Shapiro-Wilk. Berdasarkan uji tersebut dapat diketahui bahwa distribusi datanya homogen sehingga bisa dilakukan uji ANOVA satu jalur dan selanjutnya dilakukan uji posthoc. Hasil Berat Badan Tikus Berdasarkan hasil dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan berat badan tikus pada semua kelompok baik yang diberikan stres listrik maupun tidak. Sementara itu, secara statistik tidak ditemukan adanya perbedaan yang signifikan rerata berat badan tikus antarkelompok pada setiap pengukuran berat badan (nilai p>0,05).
69 Kadar TNF-α pada Jaringan Hippocampus Berdasarkan hasil analisis dengan ELISA untuk mendeteksi kadar TNF-α pada jaringan hippocampus dari enam kelompok dapat dilihat bahwa kelompok A (tikus tanpa stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) mempunyai rerata kadar TNF-α paling rendah. Kelompok B (tikus dengan stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) mempunyai rerata kadar TNF-α lebih tinggi dibanding dengan kelompok A. Pada kelompok D, E dan F (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis masing-masing 150 mg/kgbb, 300 mg/kgbb, 600 mg/kgbb) mempunyai rerata kadar TNF-α lebih rendah dibanding kelompok B. Kelompok C (tikus tanpa stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300mg/kgBB) juga mempunyai rerata kadar TNF-α lebih rendah dibanding kelompok E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300mg/kgBB) tetapi lebih tinggi bila dibandingkan dengan kelompok A. Berdasarkan analisis didapatkan perbedaan secara statistik (nilai p<0,05) antara kelompok A (tikus tanpa stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) dengan kelompok B (tikus dengan stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades). Sedangkan bila dibandingkan antara kelompok B (tikus dengan stres tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) dengan kelompok D, E dan F (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis masing-masing 150 mg/kgbb, 300 mg/kgbb, 600 mg/kgbb) ternyata tidak ditemukan perbedaan secara statistik (nilai p>0,05). Bila dibandingkan antara kelompok C (tikus tanpa stres dan
70 diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300mg/kgBB) dan kelompok E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak (nilai p>0,05). Kadar IL-10 pada Jaringan Hippocampus Berdasarkan hasil analisis dengan ELISA untuk mendeteksi kadar IL-10 pada jaringan hippocampus dari enam kelompok dapat dilihat bahwa kelompok E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300 mg/kgbb) mempunyai rerata kadar IL-10 paling tinggi. Kelompok B (tikus dengan stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) mempunyai rerata kadar IL-10 lebih tinggi dibanding dengan kelompok A (tikus tanpa stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades). Pada kelompok D dan E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis masing-masing 150 mg/kgbb dan 300 mg/kgbb) mempunyai rerata kadar IL-10 lebih tinggi dibanding kelompok B. Kelompok E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300mg/kgBB) mempunyai rerata kadar IL-10 lebih tinggi dibanding kelompok C (tikus tanpa stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300mg/kgBB) dan kelompok A. Berdasarkan analisis tidak didapatkan perbedaan secara statistik (nilai p>0,05) antara kelompok A (tikus tanpa stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) dengan kelompok B (tikus dengan stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades). Bila dibandingkan antara kelompok B (tikus dengan stres tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades) dengan kelompok D, E dan F (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis masing-masing 150 mg/kgbb, 300 mg/kgbb, 600 mg/kgbb) diketahui bahwa nilai p<0,05. Namun, setelah dilakukan analisis
71 posthoc untuk mengetahui perbedaan antar kelompok ternyata yang berbeda bermakna adalah antara kelompok D (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 150 mg/kg BB) dengan kelompok F (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 600 mg/kg BB). Sementara itu, bila dibandingkan antara kelompok C (tikus tanpa stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300 mg/kg BB) dan kelompok E (tikus dengan stres dan diberikan ekstrak etanol pegagan dengan dosis 300 mg/kg BB) ternyata didapatkan perbedaan secara statistik (nilai p<0,05). Pembahasan Kadar TNF-α pada tikus yang diberikan stres pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan tikus yang tidak diberikan stres. Hal ini mendukung penelitian yang melaporkan bahwa stres dapat menyebabkan inflamasi di hippocampus dibuktikan dengan adanya peningkatan kadar mediator inflamasi IL- 1β, IL-6, dan TNF-α di hippocampus tikus yang diberi stres kronik dibandingkan dengan tikus tanpa streshippocampus tikus yang diberi stres kronik dibandingkan dengan tikus tanpa stres (Tagliari et al., 2011). Efek antiinflamasi ekstrak etanol pegagan pada hippocampus diduga bekerja dengan menghambat produksi sitokin proinflamatorik TNF-α. Caranya dengan menghambat sel yang menghasilkan sitokin TNF-α, seperti sel mikroglia. Mekanisme kerjanya kemungkinan melalui penghambatan ekspresi TNF-α dengan menurunkan pengaturan aktivasi nuclear factor-kappa B (NF-κB) melalui penekanan fosforilasi IκB kinase dan mitogen-activated protein kinase (p38,erk1/2, JNK)(Yun et al., 2008). NF-κB merupakan salah satu faktor
72 transkripsi yang mengatur ekspresi enzim dan sitokin proinflamasi seperti inos, COX-2, dan TNF-α (Huang et al., 2011). Hasil kadar TNF-α pada hippocampus tikus stres yang diberi pegagan pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan kontrol stres meskipun tidak ada perbedaan signifikan. Pada penelitian ini, tikus dikorbankan pada hari yang sama setelah pemberian stres listrik yang terakhir. Hasil ini kemungkinan mengindikasikan bahwa dosis pegagan belum adekuat dalam mencegah peningkatan produksi TNF-α pada hippocampus tikus selama stres kronis. Pada penelitian selanjutnya mungkin perlu dipertimbangkan untuk meningkatkan dosis dan juga jangka waktu pemberian yang lebih lama setelah stres. Pengaruh pegagan dalam menurunkan kadar TNF-αdi hippocampus pascastres ini mendukung data sebelumnya tentang penurunan kadar TNF- α pada serum setelah pemberian pegagan pasca inflamasi (Huang et al., 2011;Li et al., 2009). TNF-α merupakan mediator utama yang dihasilkan sebagai respon terhadap inflamasi (Saad et al., 2011). TNF- α pada serum bisa berasal dari berbagai sumber. Efek dari sitokin proinflamasi lokal lebih signifikan dalam menyebabkan kerusakan selular pada jaringan. Pada penelitian ini, peningkatan TNF-α lokal lebih menggambarkan proseskerusakan pada hippocampus dibandingkan dengan hasil pada serum. Sementara itu, berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian ini dapat diketahui bahwa tidak didapatkan perbedaan kadar IL-10antara kelompok tikus tanpa stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades dengan kelompok tikus dengan stres dan tanpa pemberian ekstrak etanol pegagan/hanya aquades.penelitian lain melaporkan bahwa terdapat penurunan kadar IL-10 pada
73 hippocampus tikus yang diberi stres(voorhees et al., 2013), Sebaliknya, penelitian lain melaporkan adanya peningkatan kadar IL-10 pada hippocampus tikus yang diberi stress (You et al., 2011).Perbedaan hasil ini kemungkinan disebabkan antara lain oleh protokol stres yang diberikan. Pada penelitian ini protokol stres yang digunakan adalah stres listrik. Sedangkan pada penelitian lain tersebut menggunakan chronic mild stress(you et al., 2011) dan chronic restraint stress(voorhees et al., 2013). Sitokin IL-10 berperan sebagai imunomodulator yang dapat meningkat selama inflamasi untuk menggantikan kaskade sinyal sitokin proinflamasi (You et al., 2011).Pada kondisi normal, peningkatan hormon glukokortikoid dapat meningkatkan produksi IL-10 (Roque et al., 2009). IL-10 dan glukortikoid ini akan merangsang mekanisme umpan balik negatif dan menghambat poros hipotalamus-pituitari-adrenal (Roque et al., 2009). Namun bila kenaikan glukokortikoid terlalu tinggi sebagai respon terhadap stres yang berlangsung terus menerus, maka sel akan menjadi resisten terhadap glukokortikoid. Hal ini menyebabkan kegagalan mekanisme umpan balik negatif poros hipotalamuspituitari-adrenal. Resistensi glukokortikoid juga akan menyebabkan penurunan produksi IL-10 yang selanjutnya akan memicu ketidakseimbangan sitokin proinflamasi dan antiinflamasi (Roque et al., 2009).Pada penelitian ini tidak dilakukan pemeriksaan hormon-hormon yang berpengaruh pada keadaan stres. Selain itu, produksi sitokin IL-10 sendiri dipengaruhi oleh modulasi imun dari sitokin lain seperti IL-1β(Song et al., 2009). Sedangkan pada penelitian ini tidak diperiksa kadar sitokin IL-1β.
74 Penelitian tentang pegagan dan hippocampus yang telah dilakukan sebelumnya sebagian besar mengkaji tentang peran pegagan sebagai neuroprotektifpenelitian sebelumnya melaporkan bahwa pemberian ekstrak etanol pegagan diketahui dapat meningkatkan kadar Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) pada serum tikus pascastres kronis (Sari et al., 2013). Pemberian pegagan juga dilaporkan dapat meningkatkan fungsi memori pada tikus yang mengalami stres kronis (Sari &Ar-Rochmah, 2012) serta meningkatkan memori dan pembelajaran spasial pada tikus neonatus yang diberikan stres (Mohandas et al., 2005). Penelitian lain melaporkan bahwa pemberian ekstrak etanol pegagan mempunyai efek neuroprotektif dengan meningkatkan titik percabangan dendrit pada neuron CA3 hippocampus serta meningkatkan percabangan antara dendrit bagian apikal dan basal pada neuron CA3 hippocampus. (Hemamalini & Rao, 2013). Laporan tersebut mengindikasikan bahwa efek neuroprotektif dari C. Asiaticamungkin dihasilkan dari beberapa mekanisme lain seperti menghambat eksitotoksisitas, melalui beberapa jalur karena stres kronis dapat menginduksi kematian sel neuron seperti atropi dendritik melalui peningkatan aktivitas reseptor glutamat N-methyl-D-aspartate (NMDA)(Katayama et al., 2012; Hemamalini & Rao, 2013).Namun karena kematian sel neuron akan menginduksi aktivasi mikroglia, dan menyebabkan kerusakan jaringan lebih lanjut, maka kontribusi dari efek antiinflamasi dari C. Asiaticadalam mendukung efek neuroprotektif tidak dapat dikecualikan.
75 Kesimpulan dan Saran Tidak didapatkan perbedaan bermakna antara kadar TNF-α dan IL-10 pada kelompok yang diberikan ekstrak etanol pegagan dengan kelompok kontrol stres. Pada penelitian selanjutnya mungkin perlu dipertimbangkan untuk meningkatkan dosis dan juga pemberian ekstrak etanol pegagan dengan jangka waktu yang lebih lama setelah perlakuan stres.