10 III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. Penelitian dimulai pada bulan Maret 2015 hingga Mei 2016. B. Bahan dan Alat Penelitian Media yang digunakan dalam persemaian yaitu tanah, pasir dan pupuk kandang. Bahan tanam berupa rimpang Jahe merah. Bahan pembuatan media MS yaitu gula pasir, agar, larutan hara makro, larutan hara mikro, vitamin, larutan FeDTA, NAA, BAP, dan aquades. Bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan antara lain eksplan berupa tunas, spirtus, bahan pemutih, sabun deterjen, aquades steril, aquades, fungisida, alkohol 70%, bakterisida, antibakteri (Cefradroxil), antiseptik cair, tisu, kertas buram. Alat yang digunakan dalam persemaian adalah cangkul dan bambu. Peralatan pembuatan media antara lain hot plate,magnetic stirrer, gelas ukur, gelas beaker, autoclave, botol kultur, tutup botol, phmeter. Peralatan yang digunakan dalam penanaman eksplan antara lain Laminar Air Flow (LAF), lampu bunsen, pinset, pisau, petridish, plastik wraping dan botol steril. C. Perancangan Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap 2 faktor yaitu BAP dengan taraf 0, 2, 4, 6 ppm dan NAA dengan taraf 0 ; 0,5 ; 1 ; 1,5 ppm. Adapun kombinasi perlakuan kedua ZPT adalah sebagai berikut: a. B 0 N 0 = 0 ppm BAP + 0 ppm NAA (Kontrol) b. B 0 N 1 = 0 ppm BAP + 0,5 ppm NAA c. B 0 N 2 = 0 ppm BAP + 1 ppm NAA d. B 0 N 3 = 0 ppm BAP + 1,5 ppm NAA e. B 2 N 0 = 2 ppm BAP + 0 ppm NAA f. B 2 N 1 = 2 ppm BAP + 0,5 ppm NAA g. B 2 N 2 = 2 ppm BAP + 1 ppm NAA 10
11 h. B 2 N 3 = 2 ppm BAP + 1,5 ppm NAA i. B 4 N 0 = 4 ppm BAP + 0 ppm NAA j. B 4 N 1 = 4 ppm BAP + 0,5 ppm NAA k. B 4 N 2 = 4 ppm BAP + 1 ppm NAA l. B 4 N 3 = 4 ppm BAP + 1,5 ppm NAA m. B 6 N 0 = 6 ppm BAP + 0 ppm NAA n. B 6 N 1 = 6 ppm BAP + 0,5 ppm NAA o. B 6 N 2 = 6 ppm BAP + 1 ppm NAA p. B 6 N 3 = 6 ppm BAP + 1,5 ppm NAA Berdasarkan kedua faktor tersebut, diperoleh 16 kombinasi perlakuan. Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh jumlah total percobaan sebanyak 48 sampel. 1. Persemaian D. Pelaksanaan Penelitian Tata laksana penelitian sebagai berikut: Penyemaian dilakukan di lahan daerah Desa Pondok, Kecamatan Mojolaban, Kabupaten Sukoharjo. Bahan tanam berasal dari rimpang Jahe merah. Rimpang ditanam pada media campuran pasir, tanah dan pupuk kandang. 2. Pencucian botol kultur Botol yang digunakan yaitu botol kaca (seperti botol selai) berdiameter 6 cm dengan tinggi ± 12 cm. Selanjutnya mencuci botol menggunakan sabun deterjen. Pertama-tama, botol direndam dalam air kemudian dicuci bagian luar dan dalam botol. Setelah itu dibilas dalam air mengalir sebanyak dua kali pembilasan. 3. Pembuatan larutan stok Larutan stok terdiri dari larutan hara mikro, larutan hara makro, FeDTA, vitamin, BAP dan NAA. Larutan hara makro terdiri dari campuran1900 mg/l KNO 3, 1650 mg/l NH 4 NO 3, 370 mg/l MgSO 4.7H 2 O, 440 mg/l CaCl 2.2H 2 O, 170 mg/l KH 2 PO 4. Larutan hara mikro terbuat dari campuran 6,2 mg/l H 3 BO 3, 15,6 mg/l MnSO 4. 4 H 2 O, 8,6 mg/l ZnSO 4.7H 2 O, 0,25 mg/l Na 2 MoO 4.2H 2 O, 0,025 mg/l CuSO 4.5H 2 O, 0,025 mg/l CoCl 2.6H 2 O. FeDTA terdiri dari campuran37,3 mg/l disodium EDTA dan 27,8 mg/l
12 FeSO 4.7H 2 O. Vitamin terbuat dari campuran100 mg/l nicotinic acid, 0,5 mg/l thiamine hydrochloride, 0,5 mg/l pyridoxine hydrochloride dan myo-inositol. Pembuatan larutan stok BAP dan NAA dengan cara menimbang serbuk BAP dan NAA masing-masing sebanyak 10 mg masing-masing. Kemudian ditetesi NaOH sebagai pelarut kemudian diencerkan dengan 100 ml aquades. Setelah pembuatan larutan stok selesai, semua dimasukkan dalam botol dan disimpan dalam refrigerator. 4. Pembuatan media MS Media yang digunakan adalah media MS. Media MS terdiri dari gula, larutan makro, larutan mikro, larutan vitamin, FeDTA dan agar. Takaran yang digunakan untuk membuat media MS 1 liter yaitu gula 30 gram, larutan makro 50 ml, larutan mikro 10 ml, vitamin 50 ml, FeDTA 50 ml dan 8 gram agar. Semua bahan dicampur dan dimasak hingga mendidih. Setelah mendidih, media dipindahkan kedalam botol kultur. Takaran 1 liter media hanya untuk 40 botol kultur. Setelah itu, botol yang berisi media dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilisasi selama 30 menit kemudian tekan tombol drying dan tunggu selama 15 menit. 5. Sterilisasi alat Alat-alat seperti pisau, pinset, petridish dicuci hingga bersih kemudian dibungkus kertas koran dan disterilisasi menggunakan autoklaf selama 30 menit. Kemudian tekan tombol drying dan tunggu selama 15 menit. 6. Sterilisasi eksplan Eksplan yang digunakan berupa tunas yang muncul pada rimpang Jahe merah. Eksplan yang digunakan berasal dari tanaman muda. Sterilisasi dengan dua cara yaitu di luar LAF dan di dalam LAF. a. Sterilisasi diluar LAF Pertama-tama, tunas dipotong ±5 cm (termasuk bonggolnya). Kemudian, eksplan dibersihkan dari kotoran dengan air mengalir. Setelah itu, eksplan dicuci menggunakan larutan deterjen secukupnya dan digojog hingga bersih. Kemudian eksplan dibilas dengan aquades hingga busa hilang. Eksplan direndam dalam larutan fungisida 1 gram/100 ml aquades
13 dan bakterisida 1 gram/100 ml aquades selama 30 menit sambil digojog agar tidak mengendap. Kemudian bilas dengan aquades sebanyak tiga kali. Eksplan direndam dalam larutan chlorox 30% selama 5 menit dan bilas dengan aquades. Setelah itu, direndam dalam chlorox 15% selama 5 menit dan dibilas. Kemudian eksplan direndam dalam chlorox 10% selama 5 menit dan bilas hingga tidak berbau. Setelah direndam dalam chlorox direndam dalam alkohol 70% sebanyak 50 ml selama 1 menit. Kemudian bilas dengan menggunakan aquadest. Eksplan kemudian direndam dalam cairan antiseptik dan larutan betadine masing masing 5 menit. b. Sterilisasi didalam LAF Eksplan digojog dengan aquades steril hingga dua kali. Kemudian dicelupkan spirtus dan dibakar dalam api bunsen. Setelah dibakar eksplan kemudian dibersihkan dan dipotong hingga sumber kontaminan hilang. Setelah ukuran eksplan sudah sesuai, sebelum ditanam di media eksplan terlebih dahulu dicelupkan kedalam larutan antibiotik (Cefradroxil). 7. Penanaman eksplan Penanaman eksplan dilakukan didalam LAF. Setelah proses sterilisasi diluar dan didalam LAF selesai maka eksplan siap untuk ditanam. Semua kegiatan penanaman dilakukan didalam LAF untuk menghindari adanya kontaminasi baik dari jamur maupun bakteri. 8. Pemeliharaan Pemeliharaan dilaksanakan setiap hari dengan penyemprotan alkohol setiap 3 hari sekali. E. Pengamatan Peubah Peubah pengamatan yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Saat muncul tunas Pengamatan dilakukan pada saat tunas mulai muncul dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan waktu muncul tunas dilakukan dengan hitungan hari setelah tanam (HST).
14 2. Jumlah tunas Pengamatan dilakukan pada saat tunas sudah tumbuh dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan jumlah tunas dilakukan pada akhir penelitian. 3. Tinggi tunas Pengamatan tinggi tunas dilakukan pada saat akhir penelitian. Tinggi tunas diukur dari pangkal tunas sampai ujung daun terpanjang. 4. Saat muncul akar Pengamatan dilakukan pada saat akar mulai muncul dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan waktu muncul akar dilakukan dengan hitungan HST. 5. Jumlah akar Pengamatan dilakukan pada saat akar sudah tumbuh dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan akar dilakukan pada akhir penelitian. 6. Panjang akar Pengamatan panjang akar dilakukan pada akhir penelitian. Panjang akar diukur dari pangkal akar sampai ujung akar terpanjang. 7. Saat muncul daun Pengamatan dilakukan pada saat daun mulai muncul dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan waktu muncul daun dilakukan dengan hitungan HST. 8. Jumlah daun Pengamatan dilakukan pada saat daun sudah tumbuh dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan jumlah daun dilakukan pada akhir penelitian. F. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis deskriptif.