BAB IV. PENETAPAN HAYATI DENGAN MIKROBIA Materi yang akan disampaikan meliputi: Sistem Hayati : - Bacteria - ragi (yeast) - jamur Obat yang diuji: 1. Antibiotika (bactericide, fungicide) 2. Vitamin (Vit.B, Ca-Pantotenat, B12, Niasinamid) Respon: 1. Antibiotika: Kematian mikroorganisme (m.o.) 2. Vitamin: Pertumbuhan mikroorganisme (m.o) Bentuk media dari hasil yang diamati: 1. Lempeng/plate (media padat pada petrie disk): diameter Zone of Inhibition pada media agar 2. Tabung/turbidimetri (media cair pada tabung): kejernihan dari media Cara Pengujian: 1. Berbagai kadar (antibiotika) a.b. yang diuji (dan konsentrasi rendah ke tinggi) 2. Berbagai kadar a.b. standard (dari konsentrasi rendah ke tinggi) 3. Gunakan: a. Jenis sistem hayati yang sama b. Medium yang sama dan sesuai untuk pertumbuhan m.o. c. Kondisi yang sama: suhu (37 C), lama inkubasi, aerasi d. Koloni organisme yang homogen 4. Ukur diameter zone penghambatan atau tingkat kejernihan pada tiap kadar a.b. 5. Buat Plot Kadar terhadap Respon 6. Tentukan potensi a.b. yang diuji
Metode pengukuran pertumbuhan bakteri Metode 1 : Penghitungan Langsung menggunakan mikroskop yang dikalibrasi yang dihitung jumlah bakteri tidak membedakan bakteri hidup atau mati Metode 2 : Penghitungan Sel hidup aliquot kultur ditumbuhkan pada media padat, diinkubasi dari koloni yang hidup dihitung yang dihitung jumlah koloni, bukan bakteri jumlah koloni dinyatakan sebagai C. F. U. (Colony Forming Units) Metode 3 : Penghitungan Populasi Bakteri bakteri dalam suspensi akan menyerap sinar dan intensitas sinar yang lewat akan diukur mengukur bakteri hidup dan mati, juga kemungkinan partikel lain Waktu pembiakan rata-rata (Mean Generation time/doubling Time) Waktu pembiakan rata-rata yaitu: waktu yang diperlukan oleh satu set untuk membelah menjadi set berikutnya (jadi 2 set) Dasar : jika 1 sel bakteri membetah jadi 2, maka jumlah bakteri N akan menjadi: - Generasi pertama N = 1 X 2 = 2 1 - kedua N = I x 2 x 2 = 2 2 - ketiga N = 1 x 2 x 2 x 2 = 2 3 - Generasi ke-y N = 1 x = 2 y Jika mula-mula ada N o sel, maka pada generasi ke-y, poputasi sel menjadi: N = N0 x Log N = Log N0 +Y Log 2 Y = Log N - Log N o 0,301 G = T T x 0,301 = Y Log N - Log G = w N 0 G = waktu pembiakan rata-rata Hal hal yang harus diperhatikan adalah: 1. Kontaminasi m.o. lain harus dicegah
2. Steritisasi atat dan bahan harus sesuai dengan prosedur baku 3. Digunakan larutan kontrot (tanpa a.b), jika larutan ini menimbulkan hambatan harus dihitung factor koreksi A. Penetapan hayati vitamin Dasar: - Mikroorganisme tidak mensintesis vitamin - Untuk tumbuh secara normal perlu adanya vitamin - Sangat sensitif terhadap perubahan kadar senyawa/vitamin Teknik analisa: a. Media: sedimikian rupa sehingga tidak mengandung vitamin - Kontrol: tidak ada pertumbuhan - Uji: ada pertumbuhan sebanding dengan senyawa yang ditambahkan b. Pengukuran: - Turbidimetri - Titrasi, contoh asidimetri - Senyawa Baku: yang dibandingkan Contoh: 1. Niasin (Niacinamide) USP;NF - Jasad Renik: - Lactobacillus plantarum - Non pathogen - Mudah dibiakkan - Media: sederhana dengan komposisi glukosa, gelatin, ekstrak ragi - Senyawa uji: 0,05-0,5 pg/tabung - Larutan Uji: - Pertu ditambah H 2 SO 4 untuk menghidrolisa prekursor niasin, autokiaf selama 30 menit - Sisa H 2 SO 4 dinetralkan dengan NaOH 1N - Pengenceran biasa - Pengukuran : turbidimetn (spektrofotometri) 2. Vitamin B12- - Media: sangat kompteks - Jasad renik: Lactobacillus Ieichmanhi
- Larutan Baku: sianokobalamin - Pengukuran: spektrofotometri B. Penetapan hayati antibiotika Parameter yang menentukan antibiotika (a.b.) 1. Aktivitas/tingkat aktivitas terhadap mikroorganisme pathogen 2. Luas spektrum 3. Bakteriostatika atau bakterisida 4. Resistensi (cepat/lambat) 5. Daya tahan a.b. terhadap enzim bacteria 6. Stabilitas terhadap jaringan binatang 7. Protein binding 8. Farmakokinetika pada hewan uji untuk berbagai jalur pemberian 9. Apakah ab. mampu mengobati hewan terinfeksi jika ya maka harus ditentukan: a. toksisitas pada hewan uji b. Farmakokinetika pada manusia (sukarelawan) c. Efek samping: - sakit pada tempat suntikan - mual, pusing - simptom lain yang tidak teramati pada hewan 10. Dicari korelasi: a. Farmakokinetika pada hewan dan aktivitas ab. b. Farmakokinetika pada hewan dan pada manusia Test Invitro Meliputi: 1. Rentang dan tingkat aktivitas antimikroba 2. Aksi baktensida 3. Cross-resistance 4. Resisstance development 5. Pengaruh oleh enzim bakteria (rusak/berubah) 6. Stabilitas thd Enzim mamalia 7. Protein binding
Rentang dan tingkat aktivitas antimikroba 1. Pemilihan organism 2. Pemilihan media kultur - Prinsip: - Digunakan medium sederhana - Random error/variasi rendat - Kandungan senyawa pengganggu kecil - MIC dipengaruhi oleh: - PH medium - Kadar Ca - Osmolatitas 3. Evaluasi hasil - Fase I: ada/tidak aktivitas - Fase II: aktivitas dinyatakan dalam MIC untuk organisme tertentu Penilaian Antibiotika Baru Faktor-faktor penilaian: 1. Fase-fase evaluasi a.b. baru 2. Parameter yang menentukan manfaat a.b. baru 3. Uji in-vitro 4. Uji in-vivo 5. Uji farmakokinetika pada manusia Fase-fase Evaluasi Antibiotika Baru A. Fase 1 (Skrining Primer) Seleksi ab potensial, sebagian besar senyawa dibuang Uji in-vitro menggunakan m.o. patogen (standar) Bakteria: - Staphylococcus aureus - Escherichia coil - Proteus mirabilis - Pseudomonas aeruginosa Fungsi: - Candida albicans - Aspergiilus niger - Microsporum canis Aktivitas: sembarang (tidak ada kriteria khusus)
Penetapan Cross-resistance B. Fase II (Skrining Sekunder) Senyawa yang masuk nominasi, diteiw Iebih lanjut. Fase I diulang secara Iebih terperinci - Organisme: Iebih beraneka ragam tiap species, diperbanyak jenis strainnya dari isolat klinik Hasil test positif, indikasi ab. Potensial Penetapan luas spektrum a.b. Penetapan Cross-resistance Hasil test dinyatakan sebagai MIC pada species tertentu C. Fase Ill (Uji Toksisitas) Bisa dimulai sebelum Fase II selesai, Senyawa yang lobs Fase II diuji meluas, dengan berbagai species binatang Indeks terapi cukup besar akan bolos seleksi Besaran dosis ditentukan dengan farmakokinetika pada uji menggunakan binatang D. Fase IV (Farmakokinetika pada Manusia) Dari Fase III: dapat diperkirakan besaran dosis, frekuensi pemberian dan jalur pemberian Alasan: Farmakokinetika pada hewan kurang akurat meramalkan farmakokinetika pada manusia E. Fase V (Percobaan Klinik) Persiapan percobaan klinik ada pada Fase IV Menggunakan pasien: dievaluasi kelebihan dari a. b. lain