UJI-UJI ANTIMIKROBA. Uji Suseptibilitas Antimikrobial. Menggunakan cakram filter, mengandung sejumlah antibiotik dengan konsentrasi tertentu

Transkripsi

1 UJI-UJI ANTIMIKROBA KIMIA BIOESAI PS-S2 KIMIA IPB 2014 Uji Suseptibilitas Antimikrobial Metode Difusi Menggunakan cakram filter, mengandung sejumlah antibiotik dengan konsentrasi tertentu Metode Dilusi Berbagai konsentrasi antibiotik dalam media kaldu Umumnya penentuan MIC dan MBC Dr.T.V.Rao MD 2 1

2 Metode untuk Mendeteksi Antibiotik Metode Diffusi: The Kirby-Bauer test -Metode ini berdasarkan difusi antibiotik pada agar yang diinokulasi mikroorganisme. - Efek dari antibiotik diekspresikan dengan terbentuknya suatu zona pertumbuhan yang terhambat. Pengukuran sensitivitas mikroorganisme terhadap antibiotik Pengukuran dengan Uji Difusi Cakram (disk diffusion test). Larutan antibiotik/sampel uji dengan konsentrasi tertentu dikeringkan pada kertas cakram. kemudian diletakan pada permukaan agar yang sudah dioleskan mikroba yang standar. 2

3 Mengapa harus memakai metode standar? Faktor-faktor yang mempengaruhi diameter zona 1. Diffusi antibiotik 2. Medium 3. Kedalaman agar 4. Hidrasi medium 5. Ukuran Inokulum 6. Kecepatan tumbuh inokulum 7. Waktu Pre-inkubasi 8. Waktu Inkubasi Metode paling umum dan standar: Kirby-Bauer (NCCLS), Calibrated Dichotomous Sensitivity (CDS) Method Efektivitas antibiotik berhubungan dengan zona inhibisi pertumbuhannya. Makin luas diameternya, makin potensi sample antibiotik tsb.. R I S R - Resistant I - Intermediate S - Susceptible 3

4 Metode Agar Difusi Cakram Medium Mueller Hinton ketebalan 4 mm ph 7.2 to 7.4 CakramAntibiotik storage temperature -20 o C minimum Inokulum McFarland 0.5 (10 8 bacteria/ml) Inkubator Atmosphere temperatur 35 o C udara ambient 7 7 Presisi dan akurasi dilakukan dengan menggunakan galur terkontrol Suseptibilitasnya sudah diketahui. Galur Standard Staphylococcus aureus ATCC Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Galur Standar utk quality assurance 4

5 Prosedur Persiapkan kultur murni berumur jam pada medium non selektif. Sesuaikan kekeruhan sekitar standar kekeruhan 0.5 McFarland Sample 0.5 McFarland Standard Dr.T.V.Rao MD 9 Pindahkan koloni secara aseptik utk perbanyakan Pilih 4-5 koloni murni dari plat agar dan pindahkan ke dalam tabung media kaldu spt kaldu tryptic-soy. Inkubasi semalam pada 35 C atau sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0.5 McFarland, Dr.T.V.Rao MD 10 5

6 McFarland 0.5 dan tabung berisi mikroorganisme yang disesuaikan kekeruhannya Dr.T.V.Rao MD 11 Inokulasi pada lempeng secara merata Dalam 15 menit setelah distandarkan, ambil dengan aplikator steril dan tanam pada lempeng agar Muller Hinton secara rotasi berulang kali. Yakinkan utk menyerap kelebihan cairannya pada sisi lempeng. Biarkan 3-5 menit agar kelebihan cairan mengering atau terabsorb. Dr.T.V.Rao MD 12 6

7 Memilih cakram antibiotik dan memasangkannya Select disks Dr.T.V.Rao MD 13 HATI- HATI Medium agar harus ph 7.2 to 7.4 pada suhu ruangan. Permukaan harus lembab tanpa tetesan air. Cakram antibiotik harus disimpan pada 8 C atau disimpan pada -14 C Sebelum digunakan biarkan dahulu pada suhu ruangan Jangan gunakan yang sudah kadaluarsa Inkubasi pada 32 o C selama jam Dr.T.V.Rao MD 14 7

8 Hasil Antibiotik berdifusi ke dalam agar konsentrasi antibiotik terus berkurang menjauh dari cakramnya Setelah inkubasi, perhatikan daerah bening pada permukaan agar dan disebut sbg zona inhibisi incubation Bacterial growth Zone of inhibition Dr.T.V.Rao MD 15 Masalah dengan uji cakram inokulum sesuai dan inokulum yang kebanyakan 16 Dr.T.V.Rao MD 16 8

9 Masalah dengan difusi cakram cakram yang dipasang dengan benar cakram dipasang tidak tepat Dr.T.V.Rao MD 17 Metode Dilusi Minimum Inhibition Concentration (MIC) Konsentrasi terendah suatu antimikroba yang menghambat pertumbuhan bakteri. Minimum Bactericidal Concentration (MBC) or Minimum Lethal Concentration (MLC) Konsentrasi terendah dari suatu antimikroba yang menunjukkan kurang dari 0.1% inokulum awal masih bisa bertahan 18 9

10 Penentuan MIC dengan metode dilusi kaldu Tabung berisi kaldu dengan larutan antibiotik yang diencerkan dua kali lipat dan inokulum standar Setelah inkubasi semalam, MIC ditentukan berdasarkan tabung pertama pertumbuhan yang dihambat. Makin resisten suatu organisme, berarti MIC makin tinggi. Metode Dilusi Kaldu Prosedur Buat pengenceran dua kali dari antibiotik dalam kaldu Mueller-Hinton, Tryptic Soy Broth Inokulasi bakteri, inkubasi semalam. kontrols: tanpa inokulum, tanpa antibiotik Tervisualisasi kekeruhan MIC Kemudian subkultrul tabung yang tidak keruh selama semalan. Ada pertumbuhan (bacterial count) MBC 20 10

11 Antibiotik diencerkan pada berbagai konsentrasi untuk menguji MIC Grafik hasil uji MIC 11

12 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Minimum Bactericidal Concentration (MBC) Prinsip Uji Suseptibilitas Dr.T.V.Rao MD 24 12

13 Metode Dilusi Kaldu 100% dari konsentrasi awal bakteri = 5*10 5 CFU/ml 0.1% = [(5*10 5) *0.1]/100 CFU/ml = 500 CFU/ml Jumlah bakteri sebaiknya kurang dari 5 CFU (colonoy forming unit) pada plat untuk kultur dengan 0.01 ml 500*0.01 = 5 CFU 25 Antimicrobial Gradient Testing E-test Read plates after recommended Incubation Read MIC where elipse intersects scale 13