HASIL. Aktivitas Antimikrob Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob

HASIL Aktivitas Antimikrob Ekstrak asar Senyawa Antimikrob Ekstrak kasar yang didapatkan dari isolat HAL13 memiliki aktivitas antimikrob terbaik (Tabel 1). Aktivitas antimikrob spektrum luas ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat maupun ekstrak nbutanol isolat tersebut (Gambar 1). Ekstrak n butanol dari isolat HAA01 memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas yang lebih baik dibandingkan ekstrak etil asetat (Gambar 2). Ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL74 menunjukkan aktivitas antimikrob tertinggi terhadap strain uji C. tropicalis dan C. albicans. Ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL13, HAA01, maupun HAL74 mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa. Tabel 1 Diameter zona bening (dalam milimeter) yang dihasilkan dari aktivitas ekstrak kasar senyawa antimikrob (100 mg/ml) bakteri yang bersimbiosis dengan spons. HAL13 Isolat PA SA EPEC 11 CA CT Etil asetat nbutanol HAL74 Etil asetat nbutanol HAA01 Etil asetat nbutanol Metanol () Ampisilin 8 12 4 20 2 13 30 20 8 4 4 2 22 30 14 10 8 12 10 10 16 9 Tidak diuji eterangan: PA : Pseudomonas aeruginosa SA : Staphylococcus aureus EPEC 11 : Enteropatogenik Escherichia coli 11 CA : Candida albicans CT : Candida tropicalis 9 9 16 8 Tidak diuji

18 S. aureus P. aeruginosa EPEC 11 C. albicans C. tropicalis Gambar 1 Aktivitas antimikrob berspektrum luas dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL13. : ontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm. S. aureus P. aeruginosa EPEC 11 C.albicans Gambar 2 Aktivitas antimikrob berspektrum luas dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAA01. : ontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm.

19 Uji Ekstrak asar Senyawa Antimikrob menggunakan Metode Bioautografi Analisis ekstrak kasar dari tiap isolat yang diteliti menggunakan kromatografi lapis tipis menunjukkan setidaknya ada satu bercak fraksi senyawa aktif yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji S. aureus dan EPEC 11 (Tabel 2). Dua bercak fraksi senyawa aktif dengan R f 0.31 dan R f 0.81 (Gambar 3) dari ekstrak etil asetat isolat HAL13 memiliki aktivitas terhadap EPEC 11 dan S. aureus. Satu bercak fraksi senyawa dengan R f 0.85 dari ekstrak nbutanol isolat HAA01 dan R f 0.28 dari ekstrak nbutanol HAL74 memiliki aktivitas terhadap strain uji. Aktivitas antimikrob bercak fraksi senyawa aktif terlihat dari zona bening yang terbentuk di sekeliling lempeng kromatogram (Gambar 4). Tabel 2 Nilai R f bercak fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap EPEC 11 dan S. aureus. Isolat Eluen LT Nilai R f HAL13 HAL74 HAA01 nbutanol:etil asetat:air (2:5:1) heksanmetanol (2:2) nbutanol:etil asetat:air (2:5:1) R f 1 = 0.31; R f 2 = 0.81 0.28 0.85 R f 0.81 R f 0.85 R f 0.31 R f 0.28 HAL13 HAA01 HAL74 Gambar 3 romatografi lapis tipis ekstrak kasar senyawa antimikrob dari ketiga isolat bakteri yang bersimbiosis dengan spons.

20 HAL13 (R f 0.31) HAL74 (R f 0.28) HAA01 (Rf 0.85) EPEC 11 EPEC 11 EPEC 11 HAL13 (R f 0.31) HAL74 (R f 0.28) HAA01 (Rf 0.85) S. aureus S. aureus S. aureus Gambar 4 Aktivitas antimikrob yang ditunjukkan oleh bercak fraksi senyawa aktif terhadap strain uji EPEC 11 dan S. aureus. Pemurnian Senyawa Antimikrob dari Ekstrak asar Senyawa Antimikrob Isolat HAL13 Sebanyak 37 fraksi senyawa berhasil didapatkan melalui proses kromatografi kolom. Lima fraksi senyawa diketahui memiliki aktivitas antibakteri (Tabel 3), namun tidak ada fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji C. albicans dan C. tropicalis. Fraksi BS135 yang terelusi dengan eluen klorofommetanol (90%10%) serta BS1311 yang terelusi dengan eluen klorofommetanol (90%10%) menunjukkan aktivitas antibakteri berspektrum luas terbaik terhadap S. aureus, P. aeruginosa, dan EPEC 11 (Gambar 5). Fraksi BS132 yang terelusi dengan eluen kloroformmetanol (50% 50%) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap EPEC 11 dan P. aeruginosa. elima fraksi senyawa tersebut dilarutkan sesuai jenis eluennya pada kromatografi kolom dengan konsentrasi 5.4 mg/ml.

21 Tabel 3 Aktivitas antimikrob fraksi senyawa hasil kromatografi kolom. Sistem Eluen dan Fraksi Strain Uji Senyawa PA SA EPEC 11 CA CT lorofommetanol (90%10%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 Fraksi BS133 Fraksi BS134 Fraksi BS135 lorofommetanol (80%20%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 Fraksi BS133 Fraksi BS134 Fraksi BS135 Fraksi BS136 Fraksi BS137 Fraksi BS138 Fraksi BS139 Fraksi BS1310 Fraksi BS1311 lorofommetanol (70%30%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 Fraksi BS133 Fraksi BS134 Fraksi BS135 Fraksi BS136 lorofommetanol (50%50%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 Fraksi BS133 Fraksi BS134 Fraksi BS135 Fraksi BS136 Fraksi BS137 Fraksi BS138 lorofommetanol (30%70%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 lorofommetanol (10%90%) Fraksi BS131 Fraksi BS132 Fraksi BS133 Fraksi BS134 Fraksi BS135 eterangan: = Fraksi senyawa memiliki aktivitas terhadap strain uji. = Fraksi senyawa tidak memiliki aktivitas terhadap strain uji.

22 BS135 BS1311 BS135 BS1311 BS135 BS1311 EPEC 11 P. aeruginosa S. aureus Gambar 5 Aktivitas antibakteri berspektrum luas yang ditunjukkan oleh fraksi BS135 dan BS1311 yang dielusi dari kolom dengan eluen klorofommetanol (90%10%) dan klorofom metanol (80%20%). : ontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm. Pemurnian Senyawa Antimikrob dengan Teknik romatografi Lapis Tipis Preparatif Senyawa antimikrob yang terdapat dalam fraksi aktif dapat diekstraksi secara terpisah dari lempeng gel silika pada pengerjaan LT. Fraksi BS135 merupakan fraksi yang membawa paling banyak senyawa aktif dibandingkan fraksi aktif lainnya (Tabel 4). Empat senyawa dengan nilai R f 0.35, 0.41, 0.72, dan 0.87 berhasil didapatkan dari fraksi BS135 melalui teknik LT preparatif (Gambar 6). eempat senyawa tersebut memiliki aktivitas antibakteri. Analisis LT untuk fraksi aktif BS137 hanya menghasilkan satu bercak senyawa pada nilai R f 0.73. Dua senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri juga didapatkan dari fraksi BS1311. edua senyawa tersebut memiliki nilai R f 0.27 dan 0.66 (Gambar 6). Dua senyawa dengan nilai R f 0.35 dan 0.41 dari fraksi aktif BS135 menunjukkan aktivitas antibakteri terbaik terhadap strain uji EPEC 11. Zona bening yang dibentuk oleh kedua senyawa tersebut mencapai 12 mm untuk masingmasing senyawa (Gambar 7).

23 Tabel 4 Hasil analisis kromatografi lapis tipis terhadap fraksi aktif. Fraksi Aktif Eluen LT Nilai R f Bercak Senyawa Aktif λ 254 nm λ 366 nm BS135 Etil asetat R f = 0.87 R f 1 = 0.35; R f 2 = 0.41; R f 3 = 0.72 BS137 lorofommetanol R f = 0.73 R f = 0.73 (9:1) BS1311 lorofommetanol (8:2) R f = 0.27; R f = 0.66 BS132 lorofommetanol (7:3) BS133 lorofommetanol (7:3) Senyawa aktif (R f 0.72) Senyawa aktif (R f 0.41) Senyawa aktif (R f 0.35) Senyawa aktif (R f 0.66) Senyawa aktif (R f 0.27) BS135 BS1311 Gambar 6 romatografi lapis tipis fraksi aktif BS135 dan BS1311 yang menunjukkan nilai R f senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Deteksi senyawa dilakukan pada panjang gelombang UV 366 nm.

24 BS135 R f 0.41 BS135 R f 0.35 BS135 R f 0.72 BS135 R f 0.87 BS1311 R f 0.27 BS1311 R f 0.66 Gambar 7 Aktivitas antibakteri enam senyawa (R f 0.35, R f 0.41, R f 0.72, R f 0.87, R f 0.27 dan R f 0.66) yang diperoleh dengan teknik LT preparatif terhadap EPEC 11. : ontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm. Amplifikasi Fragmen DNA Penyandi Domain etosintase Fragmen DNA penyandi domain ketosintase berhasil teramplifikasi dalam penelitian ini. Visualisasi DNA amplikon hasil PCR menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) memperlihatkan DNA penyandi domain ketosintase yang diperoleh dalam penelitian ini berukuran sekitar 700 pasang basa (Gambar 8). loning dan Analisis Bioinformatika loning molekuler fragmen DNA penyandi domain ketosintase untuk ketiga isolat dalam penelitian ini telah berhasil dilakukan dengan menggunakan vektor kloning pgemteasy (PROMEGA). Pemotongan plasmid rekombinan hasil isolasi dari beberapa koloni putih E. coli DH5α menggunakan enzim restriksi EcoRI telah menghasilkan pita berukuran sekitar 3000 pb yang menunjukkan ukuran pgemteasy, serta pita berukuran sekitar 700 pb yang menunjukkan ukuran dari fragmen penyandi domain ketosintase (Gambar 9).

25 Hasil analisis bioinformatika menggunakan program BLASTX menunjukkan bahwa sekuen fragmen penyandi domain ketosintase dari isolat HAL13 dan HAA01 memiliki homologi sebesar 98% dengan domain ketosintase dari kluster gen PS tipe 1 B. subtilis BSN5. Sedangkan fragmen penyandi domain ketosintase dari isolat HAL74 memiliki homologi sebesar 87 % dari fragmen penyandi ketosintase B. amyloliquefaciens (Tabel 5). 10000 pb M 1 2 3 1500 pb 750 pb 500 pb 700 pb Gambar 8 Elektroforesis gel agarosa fragmen DNA penyandi domain ketosintase yang berukuran 700 pb hasil amplifikasi dengan teknik PCR. M = 1 kb DNA Ladder; Lane 1 = HAL13; Lane 2 = HAL74; Lane 3 = HAA01. M 1 2 3 3000 pb pgemteasy (3kpb) 750 pb DNA sisipan (700 pb) Gambar 9 Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan pgemteasys yang dipotong dengan enzim restriksi EcoR1. Lane 1: 1 b DNA Ladder ; Lane 2, 3, dan 4: Fragmen DNA penyandi domain ketosintase isolat HAL13, HAL74, dan HAA01.

26 Tabel 5 Analisis bioinformatika sekuen fragmen DNA penyandi domain ketosintase menggunakan program BLASTX. ode Isolat HAL13 HAL74 HAA01 Homologi No. Akses Identitas (%) PS tipe 1 B. subtilis BSN5 YP_004207774 98 % PS tipe 1 B. YP_001422333 87 % amyloliquefaciens PS tipe 1 B. subtilis BSN5 YP_004207774 98% evalue 2e131 2e117 2e125 Tingkat kemiripan antara sekuen asam amino domain ketosintase dari isolat HAL13 dan HAA01 terhadap B. subtilis BSN5 lebih tinggi dibandingkan sekuen domain ketosintase dari isolat HAL74. Sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL74 dan B. amyloliquefaciens FZB42 menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi (Gambar 10). Gambar 10 Penyejajaran sekuen asam amino penyusun domain ketosintase isolat HAL13, HAL74, HAA01, serta strain referensi dari GenBank menggunakan program CLUSTALW. Tanda arsir menunjukkan kesamaan asam amino yang dimiliki kelima isolat, sedangkan tanda kotak hitam menunjukkan homologi yang tinggi antara sekuen domain ketosintase.

27 Berdasarkan analisis hubungan filogeni berdasarkan sekuen asam amino penyusun domain ketosintase, isolat HAL13 dan HAA01 memiliki hubungan filogeni yang dekat dengan Streptomyces coelicolor A3 (2) dan S. avermitis MA 4680. Isolat HAL74 memiiki kekerabatan yang dekat dengan strain referensi B. amyloliquefaciens FZB42 dan B. amyloliquefaciens LL3 (Gambar 11). Isolat HAL74, B amyloliquefaciens FZB42, serta B. amyloliquefaciens LL3 membentuk kelompok filogeni yang terpisah dari isolat Isolat HAL13 dan HAA 01 serta Streptomyces coelicolor A3 (2) dan S. avermitis MA4680. Gambar 11 Pohon filogeni ketiga isolat bakteri HAL13, HAA01, dan HAL74 yang bersimbiosis dengan spons Haliclona sp. dan strain referensi dari GenBank berdasarkan sekuen asam amino penyusun domain ketosintase kompleks enzim PS tipe 1.

PEMBAHASAN Isolat HAL13 menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob yang memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas terbaik diantara dua isolat lainnya. Senyawa antimikrob yang dihasilkan isolat HAL13 dapat diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat maupun nbutanol. Aktivitas terbaik terhadap EPEC 11 dan S. aureus ditunjukkan oleh ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL13 dan HAA01. Isolat HAL74 menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob yang memiliki aktivitas yang lebih baik terhadap C. albicans maupun C. tropicalis dibandingkan ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL13 dan HAA01 (Tabel 1). Uji bioautografi terhadap ekstrak kasar senyawa antimikrob dari isolat HAL13, HAA01, dan HAL74 telah menghasilkan empat bercak fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap EPEC 11 dan S. aureus. Dua bercak fraksi senyawa aktif dengan nilai R f 0.31 dan 0.81 didapatkan dari ekstrak kasar senyawa antimikrob isolat HAL13, sedangkan ekstrak kasar senyawa antimikrob HAA01 dan HAL74 masingmasing menghasilkan satu bercak senyawa aktif dengan nilai R f 0.85 dan 0.28 (Gambar 4). Analisis bioautografi yang dilakukan dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui posisi (nilai R f ) fraksi senyawa yang memiliki aktivitas antimikrob. Fraksi aktif akan menimbulkan zona bening disekitar lempeng LT pada analisis bioautografi, sedangkan fraksi yang tidak menimbulkan zona bening merupakan pengotor pada ekstrak kasar bakteri. Metode bioautografi merupakan salah satu teknik mendeteksi fraksi senyawa aktif pada lempeng LT selain dengan reaksi pembentuk warna maupun penyinaran UV. etiga metode tersebut sangat berperan dalam proses purifikasi senyawa antimikrob (Sudirman 2005). Deteksi fraksi senyawa pada lempeng silika gel dalam penelitian ini hanya menggunakan dua panjang gelombang sinar UV yaitu 254 nm dan 366 nm serta metode bioautografi. Sehingga tidak semua fraksi senyawa yang terdapat pada ekstrak kasar terdeteksi. Enteropatogenik Escherichia coli 11 yang resisten terhadap ampisilin dan S. aureus dipilih sebagai strain uji untuk metode bioautografi dalam penelitian ini

29 karena penyakit infeksi menular yang disebabkan oleh kedua bakteri patogen tersebut yaitu diare yang disebabkan EPEC dan ISPA yang disebabkan S. aureus masih merupakan masalah klinis yang umum terjadi di Indonesia. eempat fraksi senyawa yang terdeteksi pada teknik bioautografi dalam penelitian ini aktivitasnya tidak dihambat oleh enzim βlaktamase yang dimiliki strain uji EPEC 11. Hal ini memunculkan dugaan bahwa senyawa antimikrob yang terkandung dalam keempat fraksi senyawa aktif tidak teergolong senyawa βlaktam. Isolat HAL13 dipilih untuk diteliti lebih lanjut, karena ekstrak kasar senyawa antimikrob yang dihasilkan dari isolat tersebut memiliki aktivitas hambat berspektrum luas terbaik dibandingkan dua isolat bakteri lainnya. Fraksinasi senyawa dari ekstrak kasar etil asetat HAL13 dilakukan menggunakan metode kromatografi kolom. Metode tersebut memungkinkan pemisahan senyawa dengan kuantitas yang lebih besar dibandingkan teknik LT preparatif. Analisis fraksi senyawa yang dielusi dari kolom gel silika dilakukan dengan metode LT analitik, deteksi bercak senyawa pada lempeng LT dilakukan pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Deteksi bercak senyawa pada fraksi hasil kromatografi kolom menggunakan pereaksi pewarna tidak dilakukan dalam penelitian ini. romatografi kolom merupakan metode yang umum digunakan dalam memisahkan senyawa dari campurannya. Prinsip utama pengerjaan kromatografi kolom dalam penelitian ini adalah memisahkan berbagai senyawa yang terdapat pada ekstrak kasar bakteri dengan memanfaatkan polaritas yang berbeda dari setiap senyawa. Pemilihan fase diam (absorban) dan fase gerak (eluen) merupakan faktor utama yang menentukan keberhasilan fraksinasi senyawa menggunakan kromatografi kolom. Gel silika lebih sering digunakan sebagai fase diam karena memiliki kapasitas tampung yang besar terhadap sampel dan cenderung tidak menimbulkan reaksi terhadap senyawa yang dipisahkan (Hurtubise 2010). Lima fraksi senyawa yang didapatkan dari metode kromatografi kolom memiliki aktivitas antibakteri, empat fraksi aktif (BS135, BS137, BS1311, dan BS133) memiliki aktivitas terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif. Tidak ada fraksi senyawa hasil kromatografi kolom yang mampu menghambat C. albicans maupun C. tropicalis. Aktivitas anticendawan pada ekstrak kasar HAL

30 13 diduga merupakan faktor kombinasi lebih dari satu senyawa aktif, sehingga dapat hilang akibat proses pemurnian terhadap senyawa antimikrob. Fraksinasi menggunakan kolom gel silika kemungkinan telah memisahkan senyawa aktif satu dari yang lainnya ataupun senyawa aktif dari pengotornya (Sudirman 2005). Senyawa antimikrob yang terdapat dalam fraksi aktif telah dapat ditentukan posisinya melalui teknik LT preparatif. Fraksi BS135 dan fraksi BS1311 merupakan fraksi aktif yang memiliki lebih dari satu senyawa antibakteri. Fraksi BS135 menghasilkan 4 senyawa antibakteri. Dua senyawa memiliki aktivitas terbaik pada R f 0.35 dan 0.41. Sedangkan fraksi BS1311 menghasilkan 2 senyawa antibakteri dengan nilai R f 0.27 dan 0.66. Senyawa dengan nilai R f 0.35 dan 0.41 (BS135) serta R f 0.27 (BS1311) memiliki aktivitas antimikrob yang kuat terhadap EPEC 11. etiga senyawa tersebut terdeteksi pada panjang gelombang UV 366 nm. Analisis kromatografi lapis tipis terhadap senyawasenyawa aktif yang terdapat pada fraksi BS135 dan BS1311 dilakukan menggunakan jenis eluen yang berbeda (etil asetat dan campuran klorofommetanol). Hal ini menunjukkan polaritas yang berbeda dari senyawa aktif yang terdapat pada kedua fraksi aktif tersebut. Enteropatogenik Escherichia coli 11 digunakan sebagai strain uji pada teknik bioautografi maupun uji bioaktivitas terhadap senyawa aktif hasil pemurnian menggunakan teknik LT preparatif karena bakteri tersebut memiliki nilai klinis sebagai penyebab penyakit diare dan memiliki aktivitas enzim β laktamase. Senyawa antibiotik yang tergolong βlaktam seperti ampisilin tidak akan menghambat pertumbuhan bakteri tersebut (Ogawara 1981; Jacoby 2009), sehingga senyawa aktif (Tabel 4) yang diperoleh melalui teknik LT preparatif dapat diasumsikan berbeda dari kelompok senyawa βlaktam. Hingga saat ini aktivitas dan penyebaran enzim βlaktamase diantara strainstrain enteropatogenik E. coli dan methicilinresistance S. aureus (MRSA) menjadi masalah serius dalam penanganan penyakit infeksi yang diakibatkan kedua kelompok bakteri patogen tersebut (Ogawara 1981; och 2003). Eksplorasi dan penggunaan senyawa antimikrob diluar kelompok βlaktam merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan. Tiga senyawa antimikrob dengan nilai R f 0.35 dan 0.41 (BS135) serta R f 0.27 (BS1311) yang berhasil diperoleh dalam penelitian ini memiliki potensi

31 untuk dikembangkan menjadi agen kemoterapi untuk menangani penyakit infeksi yang disebabkan oleh strainstrain EPEC maupun S. aureus yang resisten antibiotik golongan βlaktam. Senyawa bioaktif memiliki kelarutan yang berbeda pada setiap pelarut. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan tingkat polaritas dari setiap pelarut organik. Pelarut yang bersifat polar akan cenderung menarik senyawa polar, sedangkan pelarut yang nonpolar akan menarik senyawa nonpolar. Pemilihan suatu pelarut dalam ekstraksi dari substrat cair ditentukan oleh sifat solut (senyawa target), jenis substrat, dan nilai koefisien partisi serta rasio distribusi pelarut (Jeffery et al. 1989). Selektivitas dan efisiensi dalam proses ekstraksi dari substrat cair seperti kultur cair bakteri sangat tergantung pada pemilihan pelarut organik yang tepat. Pelarut organik yang digunakan sebaiknya memiliki sifatsifat seperti kelarutan yang rendah pada fase akuosa, mudah diuapkan, memiliki kompatibilitas dengan metode kromatografi yang akan digunakan, dan memiliki koefisien distribusi (nilai d ) yang tinggi (Dean 2009). Pelarut etil asetat dan n butanol digunakan dalam penelitian ini karena bersifat nonpolar terhadap air dan memiliki koefisien partisi yang tinggi terhadap substrat cair sehingga mudah dipisahkan dari kultur cair bakteri serta menghasilkan ekstrak dengan kuantitas lebih banyak. Besarnya zona hambat yang dihasilkan senyawa bioaktif dipengaruhi oleh sifat fisik dan kimia dari senyawa tersebut. Semakin besar berat molekul senyawa bioaktif akan memperbesar zona hambat yang dihasilkan. Faktor lain yang mempengaruhi penghambatan terhadap mikroorganisme antara lain adalah kepadatan populasi sel, kepekaan mikroba target terhadap senyawa antimikrob, kandungan bahan organik, dan lama waktu mikroba target terpapar bahan antimikrob (Lay 1994). Potensi genetik ketiga isolat bakteri yang bersimbiosis dengan spons Haliclona sp. dalam penelitian ini dipelajari dengan mendeteksi keberadaan kluster gen penyandi kompleks enzim PS tipe 1. Pencarian senyawa bioaktif baru dari bakteri maupun cendawan saat ini umumnya difokuskan pada eksplorasi enzim PS baru dengan menganalisis keragaman dari fragmen DNA penyandi domain ketosintase. Domain ketosintase berperan dalam reaksi kondensasi dari pemanjangan rantai poliketid dan biosintesis metabolit dengan berbagai variasi

32 pada strukturnya (Moffit & Neilan 2003). Isolat HAL13, HAL74 dan HAA01 memiliki fragmen DNA penyandi domain ketosintase yang merupakan domain terkonservasi pada kompleks enzim poliketid sintase. Berdasarkan hasil analisis bioinformatika sekuen DNA penyandi domain ketosintase menggunakan program BLASTX, sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL13 dan HAA 01 memiliki homologi sebesar 98% dengan nilai evalue sebesar 2e131 (HAL13) dan 2e125 (HAA01) terhadap B. subtilis BSN5. Nilai tersebut menunjukkan sebanyak 98% sekuen asam amino penyusun domain ketosintase isolat HAL13 dan HAA01 adalah identik dengan sekuen domain ketosintase B. subtilis BSN5 yang ada di GenBank. Sekuen domain ketosintase isolat HAL74 memiliki homologi dengan yang dimiliki B. amyloliquefaciens FZB42 sebesar 87% dengan nilai evalue sebesar 2e117. Bacillus subtilis BSN5 telah dilaporkan oleh Deng et al. (2011) mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang menghambat pertumbuhan Erwinia carotovora. Analisis menggunakan program BLASTX untuk sekuen asam amino penyusun domain ketosintase pada isolat HAL13 dan HAA01 terhadap strain referensi B. subtilis BSN5 menunjukkan nilai homologi yang sama. Analisis penyejajaran asam amino domain ketosintase untuk ketiga bakteri tersebut menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi (Gambar 10). Berdasarkan hasil tersebut terdapat kemungkinan bahwa isolat HAL13 dan HAA01 menghasilkan senyawa poliketid yang sama dengan yang dihasilkan oleh B. subtilis BSN5. Isolat HAL13 dan HAA01 juga memiliki hubungan filogeni yang dekat dengan S. coelicolor A3(2) dan S. avermitis MA4680 (strain referensi) yang tergolong ke dalam Actinobacteria. Banyak strainstrain dari kelompok Actinobacteria diketahui memiliki kluster gen penyandi enzim PS tipe 1 dan telah diketahui sebagai sumber penting dari berbagai senyawa bioaktif (Moore et al. 2005). Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang menghambat pertumbuhan patogen tanaman (Chen et al. 2007). Analisis sekuen DNA penyandi domain ketosintase dari isolat HAL74 menggunakan program BLASTX menunjukkan tingkat homologi yang rendah dengan yang dimiliki oleh B. amyloliquefaciens FZB42. Hal ini juga diperkuat

33 dengan hasil analisis penyejajaran sekuen asam amino penyusun domain ketosintase antara yang dimiliki oleh isolat HAL74 dengan B. amyloliquefaciens FZB42 (Gambar 10). Analisis hubungan filogeni menggunakan metode neighborjoining menunjukkan bahwa isolat HAL74 memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan B. amyloliquefaciens FZB42 dan B. amyloliquefaciens LL3. Rendahnya homologi sekuen asam amino penyusun domain ketosintase yang dimiliki isolat HAL74 dengan sekuen domain ketosintase yang terdapat di GenBank merupakan indikasi bahwa senyawa poliketid yang dihasilkan oleh isolat HAL74 merupakan senyawa baru.