aeruginosa ATCC secara in vitro Pembuatan filtrat Streptomyces sp... 25

Transkripsi

1 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL HALAMAN PERSETUJUAN... i KATA PENGANTAR... ii ABSTRAK... iv ABSTRACT... v DAFTAR ISI... vi DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR TABEL... xi DAFTAR LAMPIRAN... xii I. PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 4 II. TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Endofit Streptomyces sebagai Bakteri Endofit Antibakteri Pengertian dan manfaat antibakteri Mekanisme kerja antibakteri secara umum Pengukuran aktivitas antimikroba Tanaman Jahe (Zingiber officinale) Pseudomonas aeruginosa sebagai Bakteri Uji Identifikasi secara Molekuler Ekstraksi DNA bakteri Elektroforesis gel agarosa Polymerase Chain Reaction (PCR) Sekuensing DNA... 20

2 Program BLAST III. METODE PENELITIAN Metode Pengumpulan Data Lokasi dan waktu penelitian Pengambilan sampel endofit tanaman jahe Isolasi bakteri Streptomyces sp Pengamatan makroskopis koloni bakteri Streptomyces sp Pengamatan mikroskopis bakteri Streptomyces sp Uji daya hambat Streptomyces sp. terhadap pertumbuhan bakteri P. aeruginosa ATCC secara in vitro Pembuatan filtrat Streptomyces sp Uji efektivitas filtrat Streptomyces sp. dengan Pseudomonas aeruginosa ATCC Identifikasi molekuler bakteri Streptomyces dengan gen 16SrRNA Ekstraksi DNA Elektroforesis gel agarosa PCR (Polymerase Chain Reaction) Sekuensing DNA Metode Pengolahan Data Analisis data IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan identifikasi Streptomyces sp Uji Antagonis Streptomyces sp. terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC secara in vitro Uji efektivitas filtrat Streptomyces sp. dengan Pseudomonas aeruginosa ATCC Identifikasi molekuler bakteri Streptomyces yang efektif menghambat Pseudomonas aeruginosa ATCC Ekstraksi DNA Visualisasi hasil PCR... 40

3 Sekuensing DNA Hasil rekonstruksi pohon filogenetik V. SIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 60

4 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Koloni bakteri Streptomyces sp. pada media Yeast Malt Agar... 7 Gambar 2. Rimpang jahe emprit Gambar 3. Rimpang jahe merah Gambar 4. Rimpang jahe gajah Gambar 5. Pseudomonas aeruginosa pada pewarnaan Gram Gambar 6. Koloni Pseudomonas aeruginosa pada media agar Gambar 7. Siklus PCR Gambar 8. Isolat Streptomyces sp Gambar 9. Isolat Streptomyces sp Gambar 10. Isolat Streptomyces sp Gambar 11. Isolat Streptomyces sp Gambar 12. Uji antagonis antara isolat Streptomyces sp.1, Streptomyces sp.2, Streptomyces sp.3, dan Streptomyces sp.4 dengan Pseudomonas aeruginosa ATCC Gambar 13. Uji efektivitas filtrat antara isolat Streptomyces sp.1, Streptomyces sp.2, Streptomyces sp.3, Streptomyces sp.4, dengan Pseudomonas aeruginosa ATCC Gambar 14. Visualisasi hasil elektroforesis DNA Gambar 15. Visualisasi hasil amplifikasi gen 16SrRNA bakteri Streptomyces dengan primer U1 dan U Gambar 16. Hasil Penelusuran BLAST Gambar 17. Penjajaran (Alignment) Sampel Mikroba dengan Streptomyces djakartensis Gambar 18. Kontruksi pohon filogenetik Streptomyces sp. 4 berdasarkan gen 16SrRNA Gambar 19. A. Bahan yang digunakan untuk membuat media YMA B. media YMA (Yeast Malt Agar)... 60

5 Gambar 20. A. media Malt Extract Broth instan B. media Malt Extract Broth yang sudah siap digunakan Gambar 21. A. media NB (Nutrient Broth) instan B. media NB (Nutrient Broth) yang sudah siap digunakan Gambar 22. A. media NA (Nutrient Agar) instan B. media NA (Nutrient Agar) yang sudah siap digunakan Gambar 23. A. Lokasi pengambilan tanaman jahe di perkebunan jahe Banjar Pausan, Desa Buahan Kaja, Kabupaten Gianyar, Provinsi Bali; B. Bagian tanaman jahe yang diambil untuk diisolasi Gambar 24. A. Akar, batang, dan rimpang tanaman jahe yang diisolasi; B. larutan yang digunakan untuk sterilisasi permukaan Gambar 25. Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan Gram Gambar 26. Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan tahan asam Gambar 27. Uji antagonis Streptomyces sp. terhadap P. aeruginosa ATCC sebelum inkubasi 24 jam Gambar 28. Pembuatan filtrat Streptomyces sp... 67

6 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Kategori diameter zona hambat Tabel 2. Isolat Streptomyces sp. yang diisolasi dari tanaman jahe Tabel 3. Hasil pewarnaan tahan asam, pewarnaan Gram dan uji katalase isolat Streptomyces sp Tabel 4. Uji daya hambat isolat Streptomyces sp. terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC Tabel 5. Uji efektivitas filtrat Streptomyces sp. terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC Tabel 6. Mikroba yang memiliki tingkat kemiripan tertinggi dengan Streptomyces sp

7 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Pembuatan media Lampiran 2. Perhitungan uji antagonis dan efektivitas filtrat Streptomyces sp. terhadap P. aeruginosa ATCC Lampiran 3. Kumpulan foto metodelogi penelitian Lampiran 3. Hasil elektroforesis produk PCR dari PT. Genetika Science Indonesia Lampiran 4. Hasil kromatogram Streptomyces sp Lampiran 5. Hasil kromatogram Streptomyces sp Lampiran 6. Hasil kromatogram Streptomyces sp

8 I. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Kekayaan flora dan fauna yang dimiliki Indonesia didukung oleh area hutan hujan tropis yang sangat luas (Strobel, 2002). Hutan hujan tropis merupakan sumber tumbuh-tumbuhan yang mengandung senyawa bioaktif yang potensial. Keanekaragaman tumbuhan tersebut mendukung banyaknya senyawa-senyawa aktif yang bersifat antimikrobial dan berpotensi dalam penemuan dan pengembangan bahan obat (Newman et al., 2000). Beberapa tahun terakhir ini, penggalian sumber daya mikroba yang terdapat di dalam jaringan tumbuhan atau mikroba endofitik mulai banyak mendapat perhatian. Mikroba tersebut mulai dipelajari untuk berbagai tujuan, karena mikroba endofitik yang berasal dari tumbuhan tersebut masih banyak yang belum diketahui karakter dan potensinya (Melliawati et al., 2006). Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang yang mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Stone et al., 2000). Bakteri endofit ini dapat hidup di dalam pembuluh vaskular atau di ruang intersel (Zinniel et al., 2002), akar, batang, daun dan buah (Simarmata et al., 2007). Bakteri endofit mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang mempunyai potensi yang besar sebagai senyawa bioaktif (Tan dan Zou, 2001). Senyawa bioaktif tersebut dapat berasal dari hasil interaksi antara tanaman dan mikroba endofit baik bakteri maupun jamur (Gustiani, 2012). Castilo et al. (2002) telah membuktikan bahwa tanaman Snakevine ( Kennedia nigrisca) digunakan untuk mengobati luka dan infeksi yang ternyata mengandung bakteri endofit baru yaitu Streptomyces sp. strain NRRL Streptomyces tersebut mampu memproduksi antibiotik peptida baru dengan spektrum luas bernama munumbycin A-D. Selain itu Guan et al. (2005 ) melaporkan Streptomyces griseus dari tanaman Kandelia candel menghasilkan asam paminoacetophenonic yang berperan sebagai antimikroba. Streptomyces termasuk bakteri aktinomisetes dan juga merupakan bakteri endofitik yang sangat berpotensi sebagai penghasil antibiotik (Strobel, 2002).

9 Lebih dari 70% senyawa antibiotik telah dilaporkan berasal dari genus Streptomyces (Clardy et al., 2006). Streptomyces memiliki kemampuan sebagai penghasil antibiotika disebabkan oleh zat antimikroba yang mampu dihasilkan dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya yang bersifat merugikan (Rahayu, 2006). Senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh Streptomyces dilaporkan mampu menekan pertumbuhan bakteri yang bersifat patogen seperti Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa dan Stenotrophomonas maltophilia (Ceylan et al., 2008). Beberapa bakteri aktinomisetes lainnya seperti Nocardia sp. juga dilaporkan menghasilkan antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) dengan diameter zona hambat 22.7± 3.6 mm (Raningsih et al., 2015) Isolasi bakteri endofit khususnya Actinomycetes endofit dari berbagai tanaman pada dua dasawarsa terakhir telah banyak dilakukan yang berasal dari hampir semua bagian vaskular tumbuhan terna maupun tumbuhan berkayu. Beberapa diantaranya adalah rimpang jahe dan temulawak (Taechowisan dan Lumyong, 2003). Tanaman jahe dilaporkan dapat berperanan sebagai antibakteri. Salah satu penelitian yang dilakukan Akoachere et al. (2002) menunjukkan bahwa bahan aktif jahe yaitu gingerol mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Sementara itu, Chen et al. (1985) menyatakan bahwa ekstrak jahe mempunyai efek antibakteri baik terhadap Gram positif maupun Gram negatif. Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif yang bersifat nonpatogenik bagi orang sehat dan dapat menjadi patogenik jika berada pada tempat dengan daya tahan tidak normal (Jawetz et al., 2005). Beberapa penyakit yang disebabkan oleh P. aeruginosa diantaranya penyakit infeksi yaitu dermatitis, infeksi pada mata, dan infeksi pada luka bakar. Selain dapat menyebabkan infeksi, juga dapat menyebabkan infeksi pada saluran napas bagian bawah, saluran kemih, dan organ lain. Upaya penanggulangan penyakit infeksi yang disebabkan oleh P. aeruginosa dapat dilakukan dengan pemberian antibiotik (Radji, 2011). Semakin luasnya penggunaan antibiotik, menimbulkan masalah baru yaitu meningkatnya resistensi bakteri terhadap antibiotik (Mardiastuti et al., 2007). Resistensi

10 mengakibatkan pengobatan penyakit menjadi sangat sulit, juga resiko timbulnya komplikasi atau kematian (Tjay dan Rahardja, 2007). Jombo et al. (2008) melaporkan bahwa 100% isolat Pseudomonas aeruginosa dari sampel urin di UTH ( University Teaching Hospital) Nigeria telah resisten terhadap antibiotik seperti penisilin, kloksasilin, tetrasiklin, nitrofurantoin, dan asam nalidiksat. Sementara itu, penelitian yang dilakukan oleh Herawati (2011) di salah satu rumah sakit swasta di Surabaya pada tahun 2009, menunjukkan bakteri P. aeruginosa mengalami peningkatan sensitivitas terhadap antibiotik seftazidim dan siprofloksasin. Berdasarkan latar belakang di atas dengan semakin meningkatnya resistensi patogen terhadap antibiotik maka peneliti mencoba mengeksplorasi endofit Streptomyces pada tanaman jahe meliputi jahe gajah, jahe merah dan jahe emprit yang memiliki potensi antibiosis dalam menghambat pertumbuhan patogen yaitu Pseudomonas aeruginosa ATCC (ATCC = American Type Culture Collection). Selain itu, identifikasi secara molekuler perlu dilakukan untuk mengetahui jenis Streptomyces yang mampu menghambat patogen. Tujuan dari identifikasi molekuler ini untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara isolat uji dengan anggota strain acuan sehingga isolat uji dapat dipastikan termasuk ke dalam anggota strain bakteri tertentu yang memilki kemiripan secara genetis (Gunaedi et al., 2014) Rumusan Masalah Adapun masalah yang dapat dirumuskan antara lain : 1. Apakah terdapat spesies Streptomyces sp. dari endofit tanaman jahe yang diisolasi? 2. Apakah Streptomyces sp. yang telah diisolasi memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC secara in vitro? 3. Apakah filtrat yang dihasilkan isolat Streptomyces sp. yang efektif mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa ATCC 27853?

11 4. Berdasarkan identifikasi molekuler, bakteri Streptomyces apa saja yang efektif menghambat P. aeruginosa ATCC 27853? 1.3. Tujuan Penelitian Adapun tujuan yang diharapkan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah : 1. Untuk mengetahui adanya Streptomyces sp. dari endofit tanaman jahe yang diisolasi 2. Untuk mengetahui Streptomyces sp. yang efektif dalam menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC secara in vitro. 3. Untuk mengetahui filtrat yang dihasilkan isolat Streptomyces sp. yang efektif mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa ATCC Untuk mengidentifikasi secara molekuler bakteri Streptomyces yang efektif menghambat P. aeruginosa ATCC Manfaat Penelitian Dari penelitian ini diharapkan filtrat dari Streptomyces sp. mempunyai aktivitas antibiosis dengan dihasilkan antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa ATCC Di samping itu, melalui penelitian ini akan diketahui nama spesies Streptomyces sp. yang mampu menghambat P. aeruginosa ATCC