II. MATERI DAN METODE 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di enam desa yaitu tiga desa di Kecamatan Grokgak dan tiga desa di Kecamatan Seririt (Tabel 1). Ektraksi DNA dan PCR akan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Udayana dari bulan Oktober 2011 Januari 2012. 2.2 Alat dan Bahan Penelitian Bahan yang digunakan sebagai sampel adalah daun jati (Tectona grandis Linn. f.). Bahan-bahan yang digunakan untuk ektraksi dan visualisasi DNA adalah buffer ekstraksi yang mengandung 2% CTAB (Cetiltrimetilamonium bromida), 100 mm Tris-HCl ph 8, 1,4 M NaCl, 50 mm EDTA (ethylendiaminetetra-acetic acid), dan 0,2% β-merkaptoetanol, aquades, buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), kloroform isoamilalkohol (KIA) 24:1, isopropanol dingin, ethanol 70%, RNAse-A, loading buffer, ethidium bromide 0,05%, untuk elektroforesis hasil ekstraksi DNA digunakan 1% gel agarosa dan elektroforesis produk PCR digunakan 4% gel agarosa. Untuk PCR bahan yang digunakan adalah DNA cetakan Taq polymerase, buffer PCR, MgCl2, primer, air steril (H20), gliserol dan dntp. 9
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kamera digital, timbangan analitik, mortar dan pestle, vortex, microcentrifuge, autoclave, water bath, oven, pipet mikro, microtube, microwave, spatula, mesin PCR (MyGenie-Korea), unit elektrophoresis (GelMate 2000), UV-Transluminator (Biorad-Jerman), mistar, dan alat tulis. Tabel 1. Lokasi Pengambilan Sampel Daun Jati (Tectona grandis Linn. f.) No Populasi Desa Jumlah Sampel 1. Kecamatan - Desa Tinge tinge 5 Gerokgak - Desa Pengulon 5 - Desa 5 CelukanBawang 2. Kecamatan Seririt - Desa Uma Anyar 5 - Desa Kalisada 5 - Desa Tanguisia 5 TOTAL SAMPEL 30 Posisi ALT : 133 FT S : 08 12.048 E : 114 51.134 ALT : 133 FT S : 08 11.875 E : 114 49.343 ALT : 118 FT S : 08 12.110 E : 114 51.395 ALT : 301 FT S : 08 11.080 E : 114 55.500 ALT : 166 FT S : 08 11.929 E : 114 52.543 ALT : 121 FT S : 08 11.758 E : 114 56.774 10
2.3 Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan penelitian terdiri dari dua tahap yaitu persiapan bahan dan prosedur kerja. Adapun pelaksanaan masing-masing tahapan tersebut adalah sebagai berikut. 2.3.1. Persiapan Bahan Daun yang diambil adalah daun yang masih berwarna hijau segar. Kemudian daun dipotong sebesar 3x3 cm. Setelah itu daun dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan mengggunakan kertas tissue. Selanjutnya daun ditimbang hingga mencapai berat sekitar 0,2 g. 2.3.2. Prosedur Kerja 2.3.2.1. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990). Isolasi DNA dimulai dengan menggerus 0,2 g daun sampai halus di dalam mortar, kemudian ditambahkan 1 ml buffer ekstraksi yang telah mengandung 0,2% ß-mercaptoetanol dengan menggunakan mikropipet kemudian dilakukan penggerusan kembali hingga daun benar-benar halus disertai dengan penambahan 1 ml buffer ekstraksi kemudian dimasukkan kedalam tabung. 11
Tabung diinkubasi pada suhu 65ºC didalam water bath selama 45-60 menit disertai dengan membolak-balik tabung setiap 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 1x volume kloroform: isoamilalkohol (24:1). Kemudian divortex, dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Fase cair bagian atas (supernatan) dipindahkan ke tabung baru disertai dengan penambahan isopropanol dingin kemudian dibolak-balik sampai DNA terpresipitasi yang ditandai dengan munculnya benang-benang putih. Selanjutnya diinkubasi selama satu malam pada suhu -20 o C. Setelah inkubasi, dilakukan sentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Larutan isopropanol dibuang, pellet DNA dicuci dengan 500 l ethanol 70% dan disentrifugasi selama 5 menit. Kemudian ethanol dibuang secara hati-hati, dan DNA dikeringkan dengan membalik tabung di atas kertas tissue. Untuk melarutkan pellet DNA ditambahkan 100 l aquadest steril dengan menggunakan pipet mikro, dan ditambah RNAse (konsentrasi akhir 10 µg/ml) dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Selanjutnya disimpan sebagai stok pada suhu -20 o C. 12
2.3.2.2 Elektroforesis dan Penentuan Konsentrasi DNA Elektroforesis dilakukan untuk melihat hasil isolasi DNA. Jumlah DNA hasil isolasi ditentukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% dalam buffer TAE. Agarosa 0,5 gram ditambahkan dengan 50 ml buffer TAE 1X kemudian dimasukkan kedalam tabung erlemenyer, dan dipanaskan dalam microwave ± selama 1 menit sampai gel terlihat benar-benar bening. Gel dituang kedalam cetakan kemudian didiamkan pada suhu kamar hingga gel mengental, selanjutnya gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah berisi buffer TAE. Sebanyak 3 μl DNA genomik dari hasil isolasi dicampur dengan 1 μl loading dye di atas kertas parafilm, lalu dimasukkan ke dalam parit gel agarosa. Mesin elektroforesis dialiri listrik pada tegangan 100 volt selama 60 menit. Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel dalam ethidium bromide selama 30-45 menit. Pengamatan DNA dilakukan di bawah lampu UV dan dilakukan pemotretan. 2.3.2.3. Amplifikasi DNA Mikrosatelit dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Proses amplifikasi DNA adalah proses perbanyakan DNA secara enzimatis. Total keselurahan siklus pada proses amplifikasi DNA dengan PCR adalah 35 siklus yang didalamnya terdapat tiga proses, yaitu (1) proses denaturasi DNA pada suhu 94 0 C selama 1-5 menit, (2) proses penempelan DNA (annealing) pada suhu 50-55 0 C selama 3 menit (tergantung primer yang digunakan) dan (3) proses ekstensi (pemanjangan) pada suhu 72 0 C selama 2 menit serta satu siklus pemanjangan akhir 13
pada suhu 72 0 C selama 7 menit. Pada suhu tinggi pita ganda tersebut berpisah menjadi dua utas tunggal. Apabila pita ganda DNA telah terpisah, maka pada tahap kedua terjadi penempelan primer pada kedua ujung DNA sebagai titik awal pembacaan dan perbanyakan basa-basa DNA. Selanjutnya dilakukan proses pemanjangan dan pembentukan utas DNA yang baru (ekstensi). Reaksi PCR mikrosatelit DNA dilakukan dalam volume reaksi 20 µl yang mengandung: 2 µl DNA genomik, 2 µl buffer reaksi PCR, 2 µl MgCl2, 2 µl dntp, 2 µl forward primer, 2 µl reverse primer, 0,2 µl Taq DNA polymerase, 1 µl gliserol dan H2O. Dalam penelitian ini menggunakan tiga primer yaitu CIRAD1TeakH10, CIRAD1TeakF05 dan CIRAD3TeakBO2 yang dapat dilihat pada tabel berikut : Tabel 2. Nama Primer, Urutan Basa, Motif Repeat dan Ukuran Produk Mikrosatelit Primer (Verhaegen et al., 2005). Nama primer Urutan basa Motif repeat Ukuran produk (pb) CIRAD1TeakH10 F: 5-CGATACCTGCGATGCGAAGC-3 (TC)16 225 273 R:5-CGTTGAATACCCGATGGAGA-3 CIRAD3TeakB02 F: 5-ATGAAGACAAGCCTGGTAGCC-3 (TC)11GC(TC)4(N)62(AC)7 216 252 R:5-GGAAGACTGGGGAATAACACG-3 CIRAD1TeakF05 F: 5-CTTCTGCAACCCTTTTTCAC-3 R: 5-AGCCATATCTTCCTTTCTCT-3 (GA)20GT(GA)3 249 279 14
2.3.2.4 Elektroforesis Produk PCR Pengamatan hasil PCR dilakukan dengan elekroforesis pada 4% gel agarosa (Sambrook et al., 1989). Sebanyak 6 µl produk PCR dielektroforesis selama 60 menit dan diwarnai dengan ethidium bromide dan diamati pada lampu uv. Untuk menentukan ukuran produk PCR digunakan DNA ladder 100 pb. 2.4 Analisis Data 2.4.1 Penentuan Ukuran Fragment DNA Setelah dilakukan visualisasi fragment DNA, dilakukan penentuan ukuran masing-masing fragment DNA hasil PCR dengan kertas semilog. Dalam kertas semilog ukuran pb diplot sebagai sumbu y sedangkan jarak DNA hingga sumur gel diplot sebagai sumbu x. Pertama, diukur jarak migrasi DNA ladder hingga sumuran gel menggunakan penggaris. Selanjutnya diukur jarak migrasi masing-masing fragment DNA hasil PCR, kemudian ditarik garis lurus yang memotong garis antara sumbu x dan sumbu y sehingga akan didapat ukuran sebenarnya dari fragment DNA tersebut. 2.4.2 Penentuan Hubungan Kekerabatan Pita-pita DNA yang telah diketahui ukurannya kemudian di-scoring. Pita DNA diberi skor A jika ada dan skor T jika tidak ada. Selanjutnya hasil scoring dianalisis dengan software MEGA versi 5.05. Dilakukan analisis cluster dengan Neighbor-Joining Tree Method. 15
2.4.3 Menghitung Nilai Heterosigositas Analisis keragaman genetik dari tanaman jati (Tectona grandis Linn. f.) dihitung berdasarkan rumus (Nei, 1987). Frekuensi masing-masing alel setiap lokus mikrosatelit dihitung berdasarkan rumus Nei (1987) : Keterangan : j 1 Xi = (2nii + Σnij) / (2n) Xi = frekuensi alel ke-i nij = jumlah individu untuk genotip AiAj nii = jumlah individu untuk genotip AiAi n = jumlah sampel Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA mikrosatelit dengan rumus Nei (1987) sebagai berikut: ĥ = 2n (1-Σxi 2 ) / (2n-1) Keterangan : xi = frekuensi alel Lokus ke-i n = jumlah sampel ĥ = heterozigositas lokus 16
Ragam heterozigositas (Vsl(ĥ)) diantara individu dalam satu kesatuan frekuensi alel populasi pada tiap lokus DNA mikrosatelit dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Vsl(ĥ) = 2 2n(2n 1) {2(2n-2) {Σxi 3 (Σxi 2 ) 2 }+Σxi 2 -(Σxi 2 ) 2 } dan standar error (SE) diperoleh dari akar ragam heterozigositas. Rerata heterozigositas (Ĥ) dari semua lokus DNA mikrosatelit yang diuji (r) dihitung dengan rumus sebagai berikut : Ĥ = Σ ĥj / r Keterangan : ĥj = derajat heterozigositas untuk lokus ke-j r = jumlah lokus yang diuji Ĥ = rataan heterozigositas 17