BAB III METODOLOGI 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup, Institut Pertanian Bogor (PPLH IPB). Penelitian ini berlangsung mulai dari bulan Maret 2011 sampai bulan Agustus 2011. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam persiapan bibit yaitu polybag, kertas koran, kardus, gunting stek, paranet dan plastik. Dalam pembuatan media, alatalat yang digunakan yaitu gelas piala, gelas ukur biasa, pipet volumetrik, neraca analitik, ph meter, panci, pengaduk, autoklaf, karet gelang dan plastik. Sedangkan alat-alat yang digunakan dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman yaitu spatula, cawan petri, skalpel, pisau, pinset, lampu bunsen, laminar air flow cabinet, stopwatch, aluminium foil, plastik wrap dan handsprayer; serta alat tulis dan kamera digital untuk kegiatan pengamatan. Bahan yang digunakan dalam persiapan bibit yaitu kompos, pasir, sekam padi, serbuk gergaji dan cocopeat. Dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman, bahan-bahan yang digunakan yaitu fungisida, bakterisida, hormon tunas, Hyponex hijau, alkohol 70%, deterjen, air steril, HgCl 2, Clorox, antiseptik (betadine) dan eksplan tumih bagian pucuk, sedangkan dalam pembuatan media, bahan-bahan yang diperlukan yaitu larutan stok media MS (Murashige dan Skoog), agar-agar, gula pasir, air steril, antibiotik ppm, BAP (6-benzyl amino purine) dan TDZ (Thiadiazuron). 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Persiapan Bibit Tumih Anakan tumih diambil dengan menggunakan metode puteran dan cabutan. Lokasi pengambilan anakan tumih yaitu Kelurahan Kereng Bangkirai, Kecamatan Sabangau, Propinsi Kalimantan Tengah. Kriteria pengambilan anakan tumih yaitu anakan yang memiliki tinggi 10 cm hingga 50 cm, pucuk yang masih menguncup, anakan yang belum memiliki kayu dan memiliki pertumbuhan yang baik.
14 Pengambilan anakan tumih dengan metode puteran dilakukan dengan mengeruk anakan sehingga akar dan tanah menjadi satu, kemudian anakan dimasukkan ke dalam polybag. Setelah itu, polybag yang berisi anakan dimasukkan dalam plastik besar kemudian diberi air gambut hingga menutupi seperempat bagian polybag, lalu ditutup sampai rapat sehingga air tidak dapat keluar dan dimasukkan ke dalam kardus. Sedangkan anakan tumih yang diambil dengan metode cabutan dilakukan dengan mencabut anakan dan memisahkan tanah dari akar anakan, kemudian anakan dibungkus menggunakan kertas koran. Anakan yang telah dibungkus kertas koran dimasukkan ke dalam plastik besar dan diberi air gambut sampai kertas koran menjadi lembap serta dimasukkan dalam kardus. Anakan tumih yang diambil dengan metode puteran dan cabutan dipindahkan ke media tanam yang telah disediakan sebelumnya di Rumah Kaca Ekologi Hutan, Fakultas Kehutanan IPB. Anakan yang diambil dengan metode puteran langsung dipindahkan ke media tanam di dalam polybag. Pada anakan dengan metode cabutan, dilakukan pengurangan daun sehingga tersisa sepertiga daun. Tujuan dari pemotongan daun untuk mengurangi penguapan dari tanaman tersebut. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan gunting stek yang telah disterilisasi menggunakan alkohol 70%. Anakan yang telah dipindahkan diberi sungkup UV dan paranet 65% yang bertujuan untuk menjaga suhu, kelembapan dan intensitas cahaya. 3.3.2 Karantina Tanaman Karantina dilakukan untuk mensterilisasi tanaman dari kontaminan berupa jamur atau bakteri yang berasal dari alam. Proses karantina yang dilakukan yaitu dengan menyemprot hormon tunas 10 ml/l atau Hyponex hijau 2 g/l pada pagi hari. Pada sore hari disemprot fungisida (Antracol) 1 g/l + bakterisida (Agrept) 1 g/l. Dalam pelaksanaannya, proses sterilisasi hanya dilakukan satu kali dalam seminggu. Hal ini dikarenakan kondisi bibit yang belum stabil serta menghindari kematian bibit tumih. 3.3.3 Sterilisasi Proses sterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan terdiri dari sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan medium kultur, serta sterilisasi eksplan.
15 Sterilisasi lingkungan kerja untuk kultur in vitro terdiri dari lingkungan umum (ruang transfer secara keseluruhan) dan lingkungan khusus (lingkungan di dalam laminar air flow cabinet). Steriliasi alat-alat kerja yaitu pinset, skalpel, gunting dan botol kultur dicuci menggunakan deterjen sampai bersih kemudian dikeringkan. Alat-alat tersebut dibungkus menggunakan kertas koran kemudian diautoklaf selama satu jam pada suhu 121⁰C sampai 126⁰C dan tekanan 1,5 atm. Alat-alat yang telah diautoklaf dimasukkan ke dalam laminar air flow cabinet untuk disinari ultraviolet (UV). Sterilisasi pada laminar air flow cabinet yaitu dengan menyemprot permukaan atau meja kerja dengan alkohol 70% dan menghidupkan blower pada laminar air flow cabinet. Lampu ultraviolet dalam laminar air flow cabinet dinyalakan selama satu hingga dua jam sebelum melakukan kegiatan di laminar air flow cabinet, ini bertujuan untuk mengurangi kontaminan di tempat kerja. Pinset dan mata pisau yang digunakan pada proses inisiasi dicelupkan ke dalam alkohol 70% dan dibakar di atas api bunsen untuk menjaga sterilitas sebelum kegiatan pemotongan dan penanaman eksplan. Media kultur yang digunakan disterilkan menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121⁰C sampai 126⁰C dengan tekanan 1,5 atm. Untuk mengetahui perubahan atau kontaminasi yang terjadi sebelum digunakan, media perlu disimpan selama dua hingga tiga hari. Perlakuan sterilisasi yang dilakukan merupakan perlakuan yang dianggap optimal berdasarkan literatur dikarenakan jumlah eksplan yang terbatas. Proses sterilisasi eksplan yang dilakukan yaitu sterilisasi di luar dan di dalam laminar air flow cabinet. Proses sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet yaitu: 1. Anakan tumih yang telah dikarantina, diambil pucuk yang masih menguncup dari bahan induk dengan panjang 1-2 cm. 2. Eksplan pucuk yang telah dipotong dari bahan induk dicuci bersih pada air mengalir dan diusap dengan kapas basah untuk menghilangkan kotoran yang menempel. 3. Pencucian eksplan dengan deterjen sebanyak sepertiga sendok spatula selama 10 menit, kemudian eksplan dicuci bersih.
16 4. Eksplan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak dua kali masingmasing 5 menit. Proses sterilisasi lanjut di dalam laminar air flow cabinet yaitu pencucian eksplan menggunakan air steril sebanyak satu kali selama 5 menit. Setelah itu, eksplan direndam menggunakan larutan HgCl 2 (0,1 gram/100 ml) 20% selama 7 menit. Selanjutnya, perendaman eksplan dilakukan menggunakan Clorox 5% selama 3 menit, kemudian perendaman eksplan dengan larutan betadine 10 tetes/100 ml selama 5 menit. Eksplan yang telah direndam dengan betadine dibilas menggunakan air steril sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit. 3.3.4 Pembuatan Media Kultur 3.3.4.1 Pembuatan Larutan Stok Pembuatan media dasar kultur yaitu membuat larutan stok yang terdiri atas larutan stok A, larutan stok B, larutan stok C, larutan stok D, larutan stok E, larutan stok F, stok myo-inositol, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh. Masing-masing unsur pembentuk larutan stok ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam air steril sebanyak satu liter dan disimpan di tempat bertemperatur rendah (lemari es). Komposisi masing-masing larutan stok dapat dilihat pada tabel 3. Tabel 3 Komposisi masing-masing larutan stok No. Larutan Stok Rumus Kimia Komposisi/senyawa Konsentrasi MS (g/200 ml) 1 Stok A Amonium Nitrat NH 4 NO 3 66 2 Stok B Kalium Nitrat KNO 3 76 3 Stok C Kalium Dihidrogen Fosfat Asam Borat Kalium Iodida Natrium Molibdat Kobalt Klorida KH 2 PO 4 H 3 BO 3 Kl Na 2 MoO 4. 2H 2 O CoCl 2. 6H 2 O 6,8 0,25 0,03 0,01 0,01 4 Stok D Kalsium Klorida CaCl 2. 2H 2 O 1,76 5 Stok E Magnesium Sulfat Mangan Sulfat Zink Sulfat Tembaga Sulfat 6 Stok F Na 2 EDTA Besi (II) Sulfat 7 Vitamin Nicotinic Acid Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine MgSO 4. 7H 2 O MnSO 4. 4H 2 O ZnSO 4. 4H 2 O CuSO 4. 5H 2 O C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8. 2H 2 O FeSO 4. 7H 2 O C 6 H 6 N 2 O C 8 H 11 NO 3. HCl C 12 H 17 N 4 OS. HCl C 2 H 5 NO 2 8 Myo-inositol Myo-inositol 4 Sumber : Murashige dan Skoog (1962) dalam Zulkarnain (2009) 1,48 0,89 0,34 0,01 1,11 1,49 0,02 0,02 0,04 0,08
17 3.3.4.2 Pembuatan Media MS dengan Antibiotik ppm Tahapan yang dilakukan selanjutnya setelah pembuatan larutan stok adalah pembuatan medium MS (Murashige and Skoog) dengan antibiotik ppm. Langkah-langkah pembuatan media MS dengan antibiotik ppm yaitu sebagai berikut : 1. Memasukkan larutan stok A, B, C, D, E, F, myo-inositol masing-masing 5 ml, vitamin 2 ml dan antibiotik ppm sebanyak 1 ml ke dalam gelas piala. 2. Menambahkan gula pasir sebanyak 30 gram dan aquades sehingga volume menjadi 1000 ml. 3. Mengukur kadar ph larutan yang berkisar antara ph 5-6. Jika ph < 5 maka ditambahkan larutan NaOH secara bertahap sehingga media mencapai ph 5-6 dan jika ph > 6 maka ditambahkan larutan HCl secara bertahap sehingga media mencapai ph 5-6. 4. Memasukkan agar-agar bubuk sebanyak 6 gram ke dalam larutan dan diaduk hingga rata kemudian larutan media dimasukkan dalam panci dan dimasak hingga mendidih. 5. Media yang telah mendidih dimasukkan dalam botol kultur dengan ukuran masing-masing 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. 6. Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 o C sampai 126 o C dan tekanan 1,5 atm. 7. Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70% kemudian disimpan di dalam lemari dengan suhu ruangan. 3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan Pada media perlakuan, ditambahkan BAP dan TDZ sesuai konsentrasi yang telah ditentukan. Pembuatan media perlakuan ini diawali dengan proses yang sama pada pembuatan media kontrol (MS 0 + ppm 1 ml). Penambahan BAP dan TDZ dilakukan sebelum pengenceran dengan air aquades hingga menjadi volume akhir satu liter. Larutan yang telah diencerkan diukur kadar ph nya menggunakan ph meter, sehingga diperoleh kisaran ph yang umum digunakan yaitu ph 5-6. Setelah itu, larutan yang memiliki kadar ph 5-6 dituang ke dalam panci
18 kemudian dicampurkan agar-agar. Larutan yang telah tercampur agar-agar dimasak hingga mendidih dan dituang ke dalam botol-botol kultur yang telah steril masing-masing sebanyak 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 o C sampai 126 o C dan tekanan 1,5 atm. Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70% kemudian disimpan di dalam lemari dengan suhu ruangan. 3.3.5 Penanaman Cawan petri yang akan digunakan untuk penanaman, terdiri dari dua macam yaitu cawan petri berukuran kecil yang berisi tissue dan cawan petri berukuran besar. Cawan petri berukuran kecil dan berukuran besar terlebih dahulu disterilisasi menggunakan autoklaf dan cawan petri tersebut dimasukkan ke laminar air flow cabinet. Untuk peletakan eksplan dilakukan dengan dua cara yaitu cawan petri yang berukuran kecil bertujuan untuk mengurangi air yang menempel pada eksplan sedangkan cawan petri berukuran besar bertujuan untuk memotong eksplan yang berukuran 1-2 cm. Pemotongan eksplan dilakukan pada bagian eksplan yang luka dan terkena bahan sterilan. Potongan eksplan kemudian ditanam pada media kultur. Botol kultur yang telah ditanam eksplan ditutup rapat dengan menggunakan aluminium foil dan plastik kemudian diikat dengan karet dan dilapisi dengan plastik wrap. Setelah tahap inisiasi, botol kultur yang telah berisi eksplan diletakkan di ruang kultur yang suhu dan cahaya telah diatur. Cahaya yang digunakan pada pagi hingga sore hari yaitu dari pantulan cahaya matahari, sedangkan pada sore hingga malam hari menggunakan cahaya lampu. 3.3.6 Pengamatan Pengamatan terhadap hasil inisiasi dilakukan selama 4 minggu setelah tanam (MST), setiap 1 minggu sekali. Adapun parameter yang diamati adalah : 1. Persentase rata-rata eksplan tumih yang hidup ditandai dengan eksplan yang berwarna kehijauan 2. Persentase rata-rata eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan munculnya kontaminan berupa jamur dan bakteri 3. Persentase rata-rata eksplan yang mengalami pencokelatan (browning)
19 Total perlakuan yang diamati berjumlah 16 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 7 ulangan sehingga secara keseluruhan terdapat 112 satuan percobaan. Interaksi antar faktor dari percobaan yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Interaksi faktor jenis zat pengatur tumbuh dan konsentrasinya Zat Pengatur Tumbuh dan Konsentrasinya B0 B1 B2 B3 A0 A0B0 A0B1 A0B2 A0B3 A1 A1B0 A1B1 A1B2 A1B3 A2 A2B0 A2B1 A2B2 A2B3 A3 A3B0 A3B1 A3B2 A3B3 Keterangan : A0 : BAP konsentrasi 0 ml/l A1 : BAP konsentrasi 0,5 ml/l A2 : BAP konsentrasi 1 ml/l A3 : BAP konsentrasi 1,5 ml/l B0 : TDZ konsentrasi 0 ml/l B1 : TDZ konsentrasi 0,05 ml/l B2 : TDZ konsentrasi 0,1 ml/l B3 : TDZ konsentrasi 0,5 ml/l 3.4 Analisis Data Perhitungan meliputi persentase peluang hidup, kontaminasi oleh jamur dan bakteri serta pencokelatan pada eksplan menggunakan rumus sebagai berikut : % Peluang Hidup = Σ eksplan yang memiliki peluang hidup x 100% N % Kontaminasi = Σ eksplan terkontaminasi x 100% N % Pencokelatan = Σ eksplan mengalami pencokelatan x 100% N Keterangan : N = Jumlah total eksplan tiap perlakuan