BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi E. coli Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dari 10 sampel feses yang diambil dari pasien diare pada anak dikultur pada media EMBA dan MC serta dilakukan uji biokima terhadap koloni hasil kultur. Berdasarkan hasil identifikasi bakteri E. coli dari 10 sampel feses didapatkan 15 isolat bakteri E. coli. Koloni E. coli pada media EMBA menunjukkan pertumbuhan yang baik dari koloni biru-hitam gelap dengan kemilau hijau metalik ditunjukkan pada gambar 2a. A b Gambar 2. Koloni E. coli pada media EMBA (a) dan MC (b) EMBA adalah media selektif dan media diferensial. Media ini mengandung Eosin dan metilen biru, yang menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, maka media ini dipilih untuk bakteri Gram negatif. EMBA juga mengandung karbohidrat laktosa, dengan adanya karbohidrat laktosa bakteri
Gram negatif terdiferensiasi berdasarkan pada kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa. Warna media sebelum pemupukan bakteri berwarna merah keunguan. Perubahan warna hijau metalik pada media EMBA karena Escherichia coli dapat memfermentasi laktosa yang mengakibatkan peningkatan kadar asam dalam media. Kadar asam yang tinggi dapat mengendapkan methylen blue dalam media EMBA (Cheeptham, 2012 dan Lindquist, 2004). Berdasarkan hasil pengamatan, koloni E. coli pada media MC berwarna merah ditunjukan pada gambar 2b. Hal ini sesuai dengan protocol manual dari BD edisi ke-2 yang menyatakan bahwa Koloni bakteri koliform yang terisolasi akan berwarna merah jambu tua karena media MC Agar mengandung kristal violet dan garam empedu yang menghambat organisme Gram-positif memungkinkan organisme Gram-negatif untuk tumbuh. Berdasarkan hasil pengamatan uji biokimia yang telah dilakukan pada 15 isolat E. coli dari 10 sampel yang telah diambil, hasil uji biokimia indol, MR, VP, Citrat, motilitas, Urease, TSIA dan gula-gula ditunjukkan pada Tabel 1. Berikut adalah gambar hasil uji biokimia E. coli. Gambar 3. Hasil uji indol, MR, VP, motilitas, citrat, urea, TSIA dan Hasil uji gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, galaktosa, fruktosa, maltosa dan manitol) pada E. coli
Tabel 1. Hasil uji biokimia E. coli dari sampel pasien diare anak S I MR VP C M U TSIA G L S Gal F Mal Man 1a + + - - + - 1b + + - - + - 2a + + - - + - 2b + + - - + - 3a + + - - + - 3b + + - - + - 3c + + - - + - 4a + + - - + - 4b + + - - + - 5 + + - - + - 6 + + - - + - 7 + + - - + - 8 + + - - + - 9 + + - - + - 10 + + - - + - Keterangan: 1. Indol (+) terdapat cincin merah 2. MR (+) larutan berwarna merah 3. VP (-) larutan tetap bening 4. Motilitas (+) pertumbuhan di area tusukan 5. Citrat (-) tidak terjadi perubahan warna 6. Urea (-) tidak terjadi perubahan warna 7. TSIA A / A, H 2 S (-) dan gas (+) 8. Glukosa (+) larutan berwarna kuning 9. Laktosa (+) larutan berwarna kuning 10. Sukrosa (+) larutan berwarna kuning 11. Galaktosa (+) larutan terjadi kekeruhan 12. Fruktosa (+) larutan terjadi kekeruhan 13. Maltosa (+) larutan terjadi kekeruhan 14. Manitol (-) tidak terjadi perubahan warna
Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe, 2011). Produksi indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae (Hemraj, 2013). Gambar 4. Gambar rantai reaksi uji indol (Hemraj, 2013) Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan amonia. Uji indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac s ini yang menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006). Hasil uji indol pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukan adanya cincin merah pada bagian atas. Escherichia coli dan anggota lain dari organisme tingkat rendah memfermentasi gula melalui jalur asam yang merubah gas CO 2 menjadi H 2 dalam jumlah yang sedikit yang dihasilkan melalui fermentasi (McDevitt, 2010). Uji MR
bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Beberapa bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi. Methyl Red adalah indikator ph, yang tetap berwarna merah pada ph 4,4 atau kurang. (Sridhar, 2006) Setelah inkubasi, indikator ph Methyl Red ditambahkan ke dalam kultur bkteri. Methyl Red berwarna merah pada ph di bawah 4,4 (hal ini menunjukkan hasil positif) dan kuning pada ph di atas 6,0. Warna oranye menunjukkan ph menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj, 2013). Gambar 5. Fermentasi asam oleh E.coli Hasil pengamatan untuk Uji MR pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah. VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu Voges Proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri. Warna merah cherry menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna kuningcoklat menunjukkan hasil negatif. Tes ini tergantung pada pencernaan glukosa menjadi acetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan alpha-naftol (VP reagen 1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk
membentuk warna merah. Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia yang mendeteksi acetoin (Sridhar, 2006). Gambar 6. Gambar reaksi kimia uji VP (Sridhar, 2006) Asetil-metil carbinol (acetoin) adalah perantara dalam produksi butilen glikol. Dalam tes ini dua reagen, 40% KOH dan alpha-naftol ditambahkan setelah inkubasi dan terkena oksigen. Jika terdapat acetoin, acetoin akan teroksidasi dengan adanya udara dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi dengan komponen guanidin dari pepton, adanya alpha-naftol menghasilkan warna merah. Peran alpha-naftol adalah untuk katalis dan penguat warna (Hemraj, 2013). Hasil pengamatan untuk uji VP adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap larutan VP. Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas E. coli adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Leboffe, 2011)
Tes Citrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator ph bromothymol biru. Media juga mengandung garam amonium anorganik, yang digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO 2. Produksi Na 2 CO 3 serta NH 3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing menghasilkan ph basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013). Gambar 7. Reaksi kimia uji citrat (Sridhar, 2006) Uji citrat dilakukan dengan inokulasi mikroorganisme ke dalam media sintetis organik, "Simons Citrate broth" apabila natrium sitrat adalah satu-satunya sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan natrium dengan air untuk membentuk natrium karbonat yang merupakan produk alkaline yang menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini menunjukkan tes tersebut positif. (Sridhar, 2006). Hasil pengamatan untuk uji Citrat adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap media uji citrat.
Hasil pengamatan dari uji urea yang telah dilakukan adalah negatif, hal ini ditunjukan karena tidak ada perubahan warna pada media uji urea. Uji Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida terutama untuk mengetahui mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia ( NH 2 ) 2CO + H 2 O CO 2 + 2NH 3 (Brink, 2013). Gambar 8. Gambar reaksi kimia uji uerase (Leboffe, 2011) Urea dihidrolisis menjadi amonia oleh organisme positif urease akan mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari oranye menjadi merah muda. hasil pengamatan untuk uji uraease pada E. coli menunjukan hasil negati, hal ini dikarenakan Organisme negatif urease baik tidak menghasilkan perubahan warna dalam media atau mengubahnya kuning dari produk asam. (Leboffe, 2011). TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H 2 S. Selain itu, ujia TSIA ini juga dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi
Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram negatif lainnya (Lehman, 2005). Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukan hasi A / A dengan gas positif dan H 2 S negatif. Warna kuning pada keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011). Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas pada E. coli adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut dikarenakan media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak. (Leboffe, 2011). Hasil dari pengamatan untuk uji gula-gula adalah positif kecuali manitol. Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme oleh molekul organik yang bertindak memberikan donor elektron serta satu atau lebih produk organik yang bertindak sebagai penerima elektron. Fermentasi glukosa dimulai dengan memproduksi piruvat. Produk akhir fermentasi piruvat meliputi berbagai asam, alkohol, dan H 2 atau Gas CO 2. Produk akhir yang spesifik tergantung pada organisme tertentu. Setiap media terdiri dari bahan dasar yang ditambahkan karbohidrat yang dapat difermentasi. Bahan dasar tersebut termasuk di dalamnya
adalah pepton dan indikator ph. Setiap karbohidrat dapat digunakan, namun umumnya yang sering digunakan adalah glukosa, laktosa, dan sukrosa. Tabung Durham diletakkan terbalik dalam masing-masing tabung sebagai indikator adanya produksi gas. Produksi asam dari fermentasi karbohidrat menurunkan ph di bawah netral dan ternyata Deaminasi dari asam amino pepton menghasilkan amonia (NH 3 ), yang meningkatkan ph. Produksi gas ditunjukkan dengan adanya gelembung pada tabung Durham. Kemampuan media ini untuk mendeteksi produksi asam tergantung pada waktu inkubasi dan kemampuan fermentor untuk menghasilkan kelebihan yang relatif asam terhadap amonia yang dihasilkan dari proses deaminasi. (Leboffe, 2011) Menurut Ijong dan Dien tahun 2011, hasil uji biokimia untuk E. coli umumnya isolat uji memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam dan gas, indol dan metil red positif, oksidase negatif, tidak menggunakan sitrat sebagai sumber energi dan motil, sedangkan uji lainnya memberikan hasil yang bervariasi. B. Resistensi Antibiotik E. coli pada media semua isolat bakteri kemudian diuji pola resistensinya terhadap antibiotik. Antibiotik yang digunakan antara lain siprofloksasin, gentamisin, tetrasiklin, kloramfenikol dan asam nalidiksat.hasil dari pengujian antibiotik ditujukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. uji resistensi E. coli isolat feses diare anak terhadap antibiotik No Sampel Sip Gen Tetra Klo NA S R S R S R S R S R 1. 1a S - S - - R - R - R 2. 1b S - - R - R - R - R 3. 2a S - S - S - S - S - 4. 2b S - - R S - S - S - 5. 3a - R S - - R - R - R 6. 3b - R S - - R - R - R 7. 3c - R S - - R - R - R 8. 4a - R S - - R - R - R 9. 4b - R S - - R - R - R 10. 5 S - S - S - S - - R 11. 6 - R S - - R S - - R 12. 7 S - S - S - S - - R 13. 8 - R S - - R - R - R 14. 9 S - S - S - - R - R 15. 10 S - S - - R - R - R Jumlah 8 7 13 2 5 10 5 10 2 13 Persentase 53% 46,7% 86,7% 13,3% 33,3% 67,7% 33,3% 67,7% 13,3% 86,7% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 86,7 66,7 66,7 46,7 13,3 cip gen tet clo nal res sen Keterangan : Cip : siprofloksasin Tet : tetrasiklin Gen : gentamisin Clo : kloramfenikol Nal : asam nalidiksat Gambar 9. Persentase pemeriksaan uji sensitivitas E. coli isolat feses diare anak terhadap antibiotik
Hasil uji pola resistensi E. coli terhadap beberapa jenis antibiotik menujukan 53,3% sensitif dan 46,7% resisten terhadap siprofloksasin, 86,7% sensitif dan 13,3% resisten terhadap Gentamisin, 33,3% sensitif dan 67,7% resisten terhadap Tetrasiklin, 33,3% sensitif dan 67,7% resisten terhadap kloramfenikol, 13,3% sensitif dan 86,7% resisten terhadap asam nalidiksat. Pengujian terhadap resistensi E. coli terhadap antibiotik tertinggi adalah asam nalidiksat diikuti dengan tetrasiklin, kloramfenikol, siprofloksasin dan terendah adalah gentamisin. Asam nalidiksat merupakan golongan dari kuinolon, resistensi terhadap kuinolon dapat terjadi melalui 3 mekanisme, yaitu melalui mutasi Gen gyr A yang menyebabkan subunit A dari DNA girase bakteri berubah sehingga tidak dapat diduduki molekul obat lagi, perubahan pada permukaan sel bakteri sehingga mempersulit penetrasi obat ke dalam sel dan penigkatan mekanisme pemompa obat keluar sel (efflux) (Anonim, 2007). Tetrasiklin dan kloramfenikol termasuk antibiotik yang sering digunakan oleh masyarakat. Terjadinya resistensi pada kloramfenikol dan tetrasiklin ini karena terjadinya pemindahan plasmid dari bakteri resisten kepada bakteri sensitif, dan hal ini dapat juga terjadi bila bakteri yang semula sensitif terkena paparan obat. Tetrasiklin merupakan antibiotika yang paling banyak tersedia pada unit-unit pelayanan kesehatan terutama Puskesmas untuk pengobatan pasien sehingga banyak dipakai. Selain itu antibiotika ini digunakan juga untuk makanan hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga ahli. Hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotika yang dapat
menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotika yang kemudian menjadi resisten (Refdanita dkk, 2004). Siproflokasin merupakan generasi pertama golongan fluorokuinolon. Secara umum mekanisme resistensi terhadap fluorokuinolon merupakan antimikroba yang unik karena secara langsung menghambat sintesis DNA, hal ini terjadi oleh interaksi antara obat dengan kompleks yang terdiri dari DNA dan salah satu dari kedua enzim target, yaitu DNA gyrase dan topoisomerase IV. Mekanisme resistensi fluorokuinolon mencakup satu atau dua dari tiga kategori utama, yaitu perubahan dalam target obat dan perubahan dalam penetrasi obat untuk mencapai target (Hooper, 2005). Gentamisin merupakan golongan dari amino glikosida. Bakteri dapat resisten terhadap amino glikosida karena kegagalan penetrasi ke dalam bakteri, rendahnya afinitas obat pada ribosom atau inaktivasi obat oleh enzim bakteri. Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal yaitu enzim fosforilase, adenilase, asetilase, gugus hidroksil spesifik atau gugus amino. Informasi genetik untuk sintesis enzim terutama didapat melalui konjugasi, transfer DNA sebagai plasmid dan transfer faktor resisten. Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas terutama di lingkungan rumah sakit dan membawa lebih dari 20 kode enzim ini bertanggung jawab terhadap penyempitan spektrum kanamisin, gentamisin dan tobramisin (Refdanita dkk, 2004). Hasil penelitian menunjukan 86,7% E. coli sensitif terhadap antibiotik gentamisin, hal ini menunjukan bahwa disc antibiotik gentamisin mampu menghambat sintesis protein dari E. coli melalui kerja di ribosom.
Berikut ini adalah gambar hasil uji antibiotik pada media MHA 1 2 Keterangan : Keterangan : a. E. coli sensitif terhadap siptofloksasin a. E. coli sensitif terhadap tetrasiklin b. E. coli resisten terhadap gentamisin b. E. coli sensitif terhadap kloramfenikol c. Gambar 10. Hasil uji resistensi isolat E. coli terhadap antibiotik yang disesuaikan dengan Standart CLSi