Uji Kosser Sitrat Hidrolisis Lemak Uji Oksidase dan Katalase Hidrolisis Gelatin Motilitas Hidrolisis Kasein Uji H2S Uji Indol Reduksi Nitrat

Transkripsi

1 3 aseptik lalu diinkubasi selama 36 jam pada suhu 27 C. Setelah terlihat pertumbuhan bakteri, ditetesi lugol di sekitar biakan dan dibiarkan ±5 menit. Pengamatan dilakukan pada bagian berwarna biru dan tidak berwarna, dicatat hasilnya. Hidrolisis Lemak Cawan petri steril dibagi menjadi 4 daerah, diberi nama bakteri yang akan diinokulasikan beserta tanggal inokulasi. Media agar lemak steril dituang hingga menutupi permukaan cawan, diputar perlahan hingga beku. Bakteri diinokulasikan ke 4 daerah, dan dinkubasi pada suhu 30 C selama 48 jam. Setelah terlihat pertumbuhan bakteri, terusi 5% diteteskan di sekitar biakan, dibiarkan menit dan diamati hasil yang terbentuk. Hidrolisis Gelatin Sebanyak 4 tabung media agar gelatin steril disiapkan. Tiga tabung diinokulasi bakteri, 1 tabung sebagai kontrol. Keempatnya dinkubasi pada suhu 37 C selama 2 7 hari. Pengamatan dilakukan dalam wadah berisi es. Hidrolisis Kasein Cawan petri steril dibagi menjadi 4 daerah, diberi nama bakteri yang akan diinokulasikan beserta tanggal inokulasi. Media agar susu steril dituang hingga menutupi permukaan cawan, diputar perlahan hingga beku, lalu 1 ose bakteri diinokulasikan pada keempat daerah. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 3 7 hari, hasil yang terbentuk diamati perubahannya. Uji Indol Sebanyak 2 tabung berisi kaldu tripton 1% dan 1 tabung berisi kaldu tripton 1% + glukosa 1% diinokulasi dengan biakan bakteri. Satu tabung lainnya berisi kaldu tripton tanpa penambahan biakan (kontrol). Keempat tabung diinkubasi pada suhu 37 C selama 2 7 hari. Setelah masa inkubasi selesai, tabung berisi biakan dan tabung kontrol ditambahkan pereaksi Kovacs, dikocok perlahan hingga terlihat adanya lingkaran merah (positif). Uji Merah Metil dan Voges Proskauer Sebanyak 1 ose bakteri diinokulasi ke dalam media MR VP cair, diinkubasi pada suhu 35 C selama 48 jam. Kirakira 2 ml suspensi kultur dipindahkan ke tabung steril untuk uji merah metil (MR) dan diberi 5 tetes indikator MR. Untuk uji Voges Proskauer (VP), sebanyak 5 ml sisa kultur dituang ke dalam tabung steril, ditambahkan berturutturut 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes reagen αnaftol 1%. Campuran dikocok hingga larut sempurna dan dibiarkan selama 30 menit. Perubahan yang terjadi diamati. Uji Kosser Sitrat Agar Kosser sitrat diinokulasi dengan isolat bakteri, lalu diinkubasi dalam suhu 35 C selama 48 jam. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna biru pada medium. Uji Oksidase dan Katalase Untuk uji oksidase, isolat bakteri yang tumbuh di permukaan agar ditambahkan 1 2 tetes reagen oksidase, lalu terbentuknya warna biru pada media diamati selama 30 detik. Untuk uji katalase, pada koloni bakteri diteteskan 1 2 tetes H 2 O 2 3%, diamati terbentuk atau tidaknya gelembung udara. Motilitas Isolat bakteri ditanam dalam agar tegak dengan metode stab (tusuk) kurang lebih ¾ tinggi tabung, tetapi tidak sampai menyentuh dasar tabung. Kultur diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, kemudian hasilnya diamati. Uji H 2 S Pada 2 tabung yang berisi media TSIA steril, diinokulasikan 1 ose isolat bakteri dengan metode tusuk, lalu diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Diamati terbentuk atau tidaknya blackening/area hitam pada media di daerah inokulasi bakteri. Reduksi Nitrat Isolat bakteri diinokulasi ke dalam tabung berisi media NB steril, dan satu tabung media disiapkan sebagai kontrol. Kedua tabung diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Untuk uji nitrit, pada masingmasing tabung ditambahkan 1 ml asam sulfanilat dan α naftilamina lalu dikocok dan diamati hasilnya. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Regenerasi Kultur Murni Mikrob yang berasal dari isolat kultur murni diremajakan menggunakan media agar laut. Komposisi media disesuaikan dengan lingkungan atau area yang akan didegradasi oleh mikroorganisme tersebut. Media agar laut dipilih karena mengandung mineral yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikrob. Hal

2 4 ini dimaksudkan agar bakteri yang tumbuh merupakan bakteri yang berperan dalam proses degradasi limbah hidrokarbon (Dwipayana & Herto 2010). Regenerasi isolat ini dilakukan pada suhu 30 C selama 24 jam. Regenerasi diawali dengan pengenceran sampel isolat dilanjutkan dengan penanaman sampel ke dalam media NA. Pengenceran bertujuan agar koloni yang tumbuh tidak terlalu padat sehingga memudahkan dalam identifikasi selanjutnya (Dwipayana & Herto 2010). Hasil regenerasi dapat dilihat pada Gambar 1. 4). Isolat MY 12 bentuk, elevasi, dan permukaannya sama, tetapi warna koloninya agak kuning. Warna koloni ini dimiliki oleh golongan Pseudomonas sp. Sementara isolat MY FLR memiliki tepian dan permukaan koloni yang berbeda, yaitu elevasi datar, permukaan berserabut halus yang lazim dijumpai pada golongan kapang (Gambar 2). Gambar 2 Isolat koloni bakteri MY FLR. Gambar 1 Hasil regenerasi isolat bakteri. Morfologi Isolat Bakteri Pengamatan morfologi bakteri dilakukan terhadap isolat bakteri berumur 24 jam. Morfologi yang diamati meliputi bentuk, elevasi, warna, dan permukaan koloni. Pengamatan dilakukan secara visual. Pengamatan ini penting dilakukan sebagai dasar pengujian selanjutnya. Hasil pengamatan morfologi koloni isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Morfologi koloni Isolat Bentuk Elevasi Warna Permukaan MY 1 Bulat Naik Krem MY 3 Bulat Naik Krem MY 6 Bulat Naik Krem MY 8 Bulat Naik Krem MY 9 Bulat Naik Krem MY 10 Bulat Naik Krem MY 11 Bulat Naik Krem Mengilat MY 12 Bulat Naik Agak kuning MYFLR Bulat Datar Krem Berserabut halus Tabel 1 memperlihatkan bahwa isolat dengan kode MY 1, MY 3, MY 6, MY 8, MY 9, MY 10, dan MY 11 memiliki ciri morfologi yang serupa, yaitu bentuk bulat, elevasi naik, warna krem, dan permukaan halus (Gambar 1) sehingga diduga masuk ke dalam genus Bacillus sp (Lampiran Fisiologi Isolat Bakteri Mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur, dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air tempat selsel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah diidentifikasi ialah dengan metode pewarnaan. Pengamatan meliputi pewarnaan sederhana, pewarnaan Gram, pewarnaan spora dan kapsul. Pewarnaan Gram merupakan suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besar, yaitu Gram positif dan Gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Berdasarkan pewarnaan Gram, isolat dengan kode MY 1, MY 3, MY 6, MY 8, dan MY 9 tergolong Gram positif yang ditandai dengan sel berwarna ungu (Gambar 3). Bakteri Gram positif dapat menahan senyawaan kompleks kristal violet, sedangkan bakteri Gram negatif tidak mampu menahannya dan karena itu, terwarnai oleh pewarna kedua (Hadioetomo 1993), (Lampiran 5). Gambar 3 Isolat bakteri Gram positif (kiri) dan Gram negatif (kanan). Isolat MY 10, MY 11 dan MY FLR diduga bersifat Gram negatif yang ditandai dengan sel berwarna merah (Gambar 3). Isolat dengan kode MY 12 berdasarkan ciricirinya, yaitu bentuk sel batang panjang, warna koloni

3 5 krem agak kuning (MY12), dan bersifat Gram negatif (sel berwarna merah), diduga adalah Pseudomonas (Gambar 4). Keseluruhan hasil pengamatan fisiologi isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel 2. diwarnai dengan warna pembanding, yaitu safranin (merah muda), sehingga spora tetap berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah (Gambar 5). Gambar 4 Isolat koloni bakteri Gram negatif. Tabel 2 Sifatsifat fisiologi sel Isolat Bentuk Gram Spora Kapsul MY 1 Batang Positif Ada Tidak ada MY 3 Batang Positif Ada Tidak ada MY 6 Batang Positif Tidak ada Tidak ada MY 8 Batang Positif Tidak ada Tidak ada MY 9 Batang Positif Tidak ada Tidak ada MY 10 Batang Negatif Ada Tidak ada MY 11 Batang Negatif Ada Tidak ada MY 12 Batang Negatif Ada Tidak ada MY FLR Batang Negatif Tidak terlihat Tidak ada Berdasarkan sifat fisiologi dan morfologi, isolat MY 1, MY 3, MY 6, MY 8, dan MY 9 diduga masuk ke dalam genus Bacillus sp (Fardiaz 1998), sedangkan isolat MY 10, MY 11, dan MY FLR diduga genus Bacillus sp, tetapi dengan sifat Gram negatif. Isolat dengan kode MY 12 berdasarkan cirinya, yaitu bentuk sel batang panjang, warna koloni krem agak kuning, dan Gram negatif diduga termasuk genus Pseudomonas sp. Secara umum, Dharmawibawa (2004) (dalam Darmayasa 2008) mengungkapkan bahwa genus Bacillus sp dan Pseudomonas sp mampu merombak hidrokarbon minyak bumi. Pewarnaan spora dilakukan untuk mengamati kemampuan suatu bakteri menghasilkan spora yang berfungsi melindungi sel vegetatif dari kondisi ekstrem di luar sel yang dapat membahayakannya (Hadioetomo 1993). Endospora sel memiliki lapisan khusus yang sulit ditembus zat pewarna, maka dilakukan pemanasan dalam preparasi preparat selama proses pengikatan warna dasar (malasit hijau). Pemanasan bukan hanya membuat spora yang terwarnai hijau, melainkan juga sel vegetatif. Oleh karena itu, pencucian dengan air mengalir diperlukan untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang menempel pada dinding sel. Dinding sel yang tidak berwarna ini kemudian Gambar 5 Isolat bakteri penghasil spora. Hasil penelitian (Tabel 2) menunjukkan bahwa isolat dengan kode MY 1, MY 3, MY 10, MY 11, dan MY 12 memiliki endospora yang terletak di ujung dan subujung (Gambar 5). Sementara pada isolat MY 6, MY 8, MY 9, dan MY FLR tidak ditemukan endospora. Endospora dapat bersifat dorman untuk waktu yang cukup lama. Selain itu, endospora sangat tahan terhadap panas tinggi, radiasi gelombang pendek, dan bahan kimia beracun (Anonim 2000). Dengan sifat tersebut, endospora diharapkan dapat membantu mendegradasi cemaran limbah hidrokarbon. Pewarnaan kapsul dilakukan untuk mengamati keberadaan struktur khusus lapisan pelindung kapsul pada bakteri. Dari hasil identifikasi, tidak terdapat isolat yang memiliki lapisan pelindung kapsul (Gambar 6). Gambar 6 Isolat tanpa pelindung kapsul. Berdasarkan pengamatan pewarnaan kapsul diduga isolat bakteri mudah diberi perlakuan karena tidak ada pelindung kapsul yang membungkus sel. Karena itu, bakteri ini diharapkan memiliki potensi dalam merombak hidrokarbon. Aktivitas Biokimia Bakteri memperlihatkan aktivitas biokimia (pertumbuhan dan perbanyakan) dengan menggunakan bahan baku (nutrisi) dari lingkungan sekitarnya. Setiap bakteri memiliki enzim yang dapat mengurai karbohidrat, lemak, protein, atau asam amino. Metabolisme atau penggunaan molekul organik ini biasanya menghasilkan produk yang dapat digunakan untuk identifikasi dan pencirian bakteri. Karena itu pengamatan

4 6 aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme digunakan untuk identifikasi dan pencirian mikroorganisme dalam penelitian ini (Djide & Sartini 2006). Fermentasi Karbohidrat Fermentasi karbohidrat merupakan proses oksidasi karbohidrat secara biologis dalam keadaan anaerob. Hasil fermentasi berbedabeda, bergantung pada jenis bakterinya. Pada penelitian ini digunakan 3 media karbohidrat, yaitu glukosa, sukrosa, dan laktosa (Djide & Sartini 2006). Tabel 3 menunjukkan perbandingan hasil fermentasi karbohidrat ke 9 isolat bakteri dengan kontrol. Tabel 3 Fermentasi karbohidrat Isolat Fermentasi Glukosa Laktosa Sukrosa MY MY MY6 MY8 + MY MY MY MY MYFLR Keterangan: (+) perubahan warna larutan merah menjadi kuning; () tidak terjadi perubahan warna Pada uji fermentasi karbohidrat, hasil positif dilihat dari perubahan warna larutan media dari merah menjadi kuning serta pembentukan gas yang terlihat dalam tabung Durham terbalik. Perubahan warna media disebabkan oleh adanya indikator merah fenol dalam media mengalami penurunan ph dalam keadaan aerob. Hasil positif tersebut ditunjukkan oleh isolat MY 1, MY 3, MY 9, dan MY 11 untuk semua jenis karbohidrat (Gambar 7). Gambar 7 Fermentasi karbohidrat (glukosa, sukrosa, dan laktosa). Isolat dengan kode MY 6 dan MY FLR tidak mampu memfermentasikan semua jenis karbohidrat yang diujikan. MY 8 tidak mampu memfermentasi glukosa dan laktosa, MY 10 tidak mampu memfermentasi sukrosa, dan MY 12 tidak mampu memfermentasi laktosa. Hasil ini dipengaruhi oleh sifat mikrob di dalamnya, media biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan seperti suhu dan ph (Reynolds 2009). Berdasarkan kemampuan memfermentasi ketiga jenis karbohidrat, diduga isolat MY 1, MY 3, MY 9, dan MY 11 termasuk ke dalam golongan Bacillus sp (Lampiran 6). Menurut Djide dan Sartini (2006), umumnya spesies Bacillus mampu memfermentasikan glukosa dan laktosa. MY 12 yang inaktif terhadap laktosa diduga termasuk golongan Pseudomonas sp, sedangkan isolat MY FLR memberikan hasil negatif untuk ketiga jenis gula. Sifat Hidrolisis Hidrolisis Pati. Salah satu polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh mikroorganisme adalah pati (amilum) dengan hasil akhir dekstrin. Hidrolisis ini terjadi karena adanya enzim amilase yang dapat dihasilkan oleh mikroorganisme tertentu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa seluruh isolat mampu menghidrolisis pati terlihat dari perubahan warna di sekitar isolat (Gambar 8). Gambar 8 Hasil uji hidrolisis pati isolat bakteri. Zona bening (area sekitar biakan tidak menjadi biru) menandakan pati telah terhidrolisis, sedangkan daerah berwarna biru menandakan masih terdapat butirbutir pati. Tabel 4 menunjukkan adanya zona bening di sekitar biakan bakteri pada uji hidrolisis pati, kecuali isolat MY FLR. Tabel 4 Hasil uji hidrolisis pati Isolat Zona bening Keterangan MY :terbentuk zona MY 3 + MY 6 + MY 8 + MY 9 + MY 10 + MY 11 + MY 12 + bening :tidak terbentuk zona bening Berdasarkan kemampuan menghidrolisis pati, diduga isolat bakteri termasuk golongan Bacillus (Reynolds 2009). Dengan kemampuan menghidrolisis pati, bakteri diharapkan juga mampu menghidrolisis

5 7 ikatanikatan hidrokarbon dalam cemaran limbah. Hidrolisis Lemak. Hidrolisis mengurai molekul lemak menjadi gliserol dan asam lemak. Asam lemak ini kemudian dibentuk menjadi lemak bakteri atau komponen sel atau sebagai energi. Dari hasil percobaan, hanya isolat MY6 yang mampu menghidrolisis lemak (Tabel 5), dan karena itu diduga termasuk genus Bacillus (Reynolds 2009). Hasil positif ditandai dengan terbentuknya butiran berwarna hijau di sekitar biakan koloni (Gambar 9). Tabel 5 Hasil uji hidrolisis lemak MY 1 + : terbentuk butiran berwarna MY 3 MY 6 + MY 8 MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 hijau di sekitar biakan : tidak terbentuk butiran hijau di sekitar biakan koloni Gambar 9 Hidrolisis lemak isolat bakteri. Hidrolisis Gelatin. Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen. Kolagen adalah salah satu komponen dalam jaringan penghubung dan otot pada hewan. Gelatin merupakan substrat yang baik untuk menguji adanya enzim proteolitik yang dihasilkan mikrob. Larutan gelatin yang digunakan sebagai medium bersifat cair dalam suhu kamar dan padat dalam suhu es (0 4 C). Hasil pengamatan hidrolisis gelatin oleh isolat bakteri ditunjukkan pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil uji hidrolisis gelatin MY 1 +: media tetap cair meski direndam dalam MY 3 bongkahan es MY 6 : media membeku MY 8 kontrol: media tetap beku MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 Berdasarkan hasil penelitian, seluruh isolat tidak mampu menghidrolisis gelatin. Media tetap membeku ketika diletakkan dalam wadah berisi es batu (Gambar 10). Gambar 10 Hidrolisis gelatin pada isolat bakteri (setelah direndam dalam air es) Umumnya golongan Bacillus mampu menghidrolisis gelatin, tetapi identifikasi di atas menunjukkan hasil berbeda. Kemungkinan hal tersebut terjadi karena isolat bakteri tidak mampu membuat enzim gelatinase yang terbentuk karena pemadatan dan pencairan. Hidrolisis Kasein. Kasein adalah protein pokok susu, suspensi koloid yang menyebabkan susu berwarna putih. Apabila mikrob mampu menghidrolisis protein ini, maka akan tampak zona bening di sekitar koloni mikrob. Pengamatan hidrolisis kasein terhadap isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel 7. MY 1 +: media menjadi tidak berwarna/bening : media membeku kontrol: media putih susu MY 3 MY 6 MY 8 MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 Tabel 7 Hasil uji hidrolisis kasein Analisis IMViC Uji produksi indol dilakukan untuk mengetahui mikroorganisme yang dapat menggunakan asam amino baik sebagai komponen protein, komponen sel, atau kadangkala sebagai sumber energi. Asam amino ini dimodifikasi dengan berbagai cara sewaktu metabolisme. Asam amino triptofan lazim terdapat dalam protein dan dapat dengan mudah digunakan oleh mikroorganisme. Hidrolisis oleh enzim triptofanase akan menghasilkan indol dan asam piruvat (Djide & Sartini 2006). Pada

6 8 penelitian ini digunakan media cair kaya triptofan dalam bentuk tripton 1%. Indol yang terbentuk, dengan penambahan reagen Kovacs akan menghasilkan senyawa p aminobenzaldehida yang tidak larut dalam air dan membentuk warna merah pada permukaan media (Gambar 11a). a. Indol b.merah metil c. Sitrat Gambar 11 Hasil pengamatan IMViC isolat bakteri. Hanya pada sampel MY 11 terbentuk cincin merah di sekitar permukaan media, sampel lainnya tidak (Tabel 8). Hal ini menunjukkan bahwa sampel MY 11 adalah bakteri penghasil indol yang umumnya dari genus Enterobacter atau Pseudomonas. Uji dengan reagen Kovacs harus segera dilakukan setelah inkubasi. Waktu inkubasi yang terlalu lama dapat menyamarkan hasil (hasil yang didapat tidak sesuai dengan yang sebenarnya). Tabel 8 Hasil uji produksi indol MY 1 +: terbentuk cincin merah atau lingkaran merah diatas MY 3 permukaaan media setelah MY 6 penambahan pereaksi MY 8 Kovacs MY 9 : tidak terbentuk cincin merah MY 10 kontrol: tidak berwarna MY 11 + MY 12 Uji merah metil digunakan untuk menentukan terjadinya fermentasi yang menghasilkan campuran asam. Beberapa bakteri dapat memfermentasi glukosa dan menghasilkan berbagai produk asam organik sederhana yang menurunkan ph media pertumbuhan. Indikator merah metil digunakan sebagai penunjuk terjadinya perubahan ph dan akan menjadi merah pada suasana asam (ph sekitar 4.4) dan kuning pada suasana basa (ph sekitar 6.2) (Gambar 11b). Hasil positif ditunjukkan oleh isolat dengan kode MY 1, MY 3, MY 8, MY 11 dan MY 12 yang merupakan ciri golongan Bacillus sp dan Pseudomonas sp (Tabel 9). Tabel 9 Hasil uji MRVP Isolat Hasil MR VP MY 1 + MY 3 + MY 6 MY 8 + MY 9 MY 10 MY 11 + MY 12 + Keterangan: +: larutan berwarna merah : larutan berwarna sindur atau jernih Uji Voges Proskueur juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat melakukan fermentasi tetapi dengan hasil akhir 2,3butanadiol. Pada uji ini ditambahkan larutan KOH 40% dan αnaftol 1% yang dapat menentukan adanya asetoin, senyawa pemula dalam sintesis 2,3 butanadiol. Dengan larutan KOH 40%, asetoin memunculkan warna merah yang dipertegas oleh beberapa tetes larutan αnaftol 1%. Pada uji VP ini, isolat yang diuji menunjukkan hasil negatif, artinya tidak dapat menghasilkan asetoin, asetil, metil karbinol dan etanol (Gambar 12). Ciri ini umum dimiliki oleh bakteri golongan Bacillus sp. Gambar 12 Hasil pengamatan VP isolat bakteri. Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon dan energi. Penelitian ini menggunakan medium sintetik Kosser sitrat dengan natrium sitrat sebagai sumber karbon, amonia sebagai sumber nitrogen, dan indikator ph. Bila mikrob mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, ph meningkat, dan warna medium berubah dari tak berwarna menjadi biru (Gambar 11c). Hasil identifikasi ditunjukkan pada Tabel 10.

7 9 Tabel 10 Hasil uji Kosser sitrat MY 1 +: larutan berwarna biru MY 3 MY 6 MY 8 MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 : larutan tidak berwarna kontrol: larutan tidak berwarna Tidak adanya perubahan warna media, berarti isolat bakteri tidak mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Ciri ini lazim dimiliki oleh bakteri golongan Enterobacter (Lampiran 6). OksidaseKatalase Oksidase umumnya bekerja pada respirasi aerob menghasilkan CO 2 dan H 2 O dengan tujuan akhir akumulasi energi, untuk aktivitas mikroorganisme maupun prosesproses biologis lainnya (Djide & Sartini 2006). Uji oksidase positif ditunjukkan dengan warna koloni keunguan sekitar 2 menit setelah penambahan reagen oksidase (Gambar 13a). a. uji oksidase b. uji katalase Gambar 13 Hasil pengamatan oksidase dan katalase isolat bakteri. Uji katalase dilakukan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri. Enzim ini memecah H 2 O 2 (peroksida) menjadi H 2 O dan O 2 karena itu, uji katalase positif ditunjukkan oleh gelembunggelembung O 2 hasil pemecahan H 2 O 2 (Gambar 13b). Hidrogen peroksida merupakan salah satu produk respirasi aerob bakteri yang toksik sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri itu sendiri dan harus diurai (Todar 2008). Hasil keseluruhan uji oksidase dan katalase ditunjukkan pada Tabel 11. Tabel 11 Hasil uji oksidasekatalase Isolat Oksidase Katalase MY 1 MY 3 MY 6 MY 8 MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 Keterangan: (+) oksidase: warna koloni keunguan setelah ditambah reagen (10 15 detik). (+) katalase: timbulnya gelembung udara. Uji oksidase umumnya digunakan untuk membedakan golongan Pseudomonas dan Enterobacter (Reynolds 2009). Tidak ada isolat yang menunjukkan hasil positif. Hal ini dapat terjadi karena produksi sitokrom oksidase oleh isolat bakteri tersebut dihambat oleh produksi asam atau bakteri dalam isolat tidak mampu memproduksi sitokrom oksidase atau telah terkontaminasi nitrat sehingga memberikan hasil yang berbeda. Dapat pula terjadi, reagen oksidase telah kehilangan aktivitasnya atau kedaluwarsa. Katalase dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk kokus. Hasil positif, yaitu gelembung udara di sekitar koloni setelah ditambahkan H 2 O 2 3%, hanya ditunjukkan oleh isolat MY 6 (Gambar 13b). Motilitas Motilitas adalah salah satu ciri makhluk hidup, begitu juga mikroorganisme, namun dengan alat gerak yang sederhana berupa silia atau flagela. Pada percobaan ini, motilitas ditandai dari gerak pertumbuhan dalam agar tegak (bekas tusukan pada media, yang telah diinokulasi oleh biakan dan diinkubasi), ditunjukkan pada Gambar Gambar 14 Hasil pengamatan motilitas isolat bakteri.

8 10 Tabel 12 menunjukkan hasil pengamatan motilitas isolat bakteri. Sifat motil ini umumnya dimiliki oleh bakteri golongan Bacillus (Hadioetomo 1993). Tabel 12 Hasil motilitas isolat bakteri Nama Hasil Keterangan MY 1 + +: Ada pertumbuhan bakteri melebar ke MY 3 + samping daerah MY 6 + sekitar tusukan atau MY 8 + melebar di atas MY 9 + permukaan agar MY 10 + MY 11 + MY 12 + MY FLR + Analisis H 2 S H 2 S diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang seperti sistein dan metionin. Keberadaan H 2 S ditandai dengan terbentuknya sulfida yang berwarna hitam. Uji ini lazim digunakan untuk membedakan bakteri golongan Enterobacter (Djide & Sartini 2006). Tabel 13 menunjukkan tak satu pun isolat mampu menghidrolisis sulfur yang terdapat dalam medium. Tabel 13 Hasil uji H 2 S MY 1 +: terbentuk warna MY 3 MY 6 MY 8 MY 9 MY 10 MY 11 MY 12 hitam di sekitar tusukan : tidak terbentuk Reduksi Nitrat Reduksi nitrat dilakukan untuk menguji kemampuan bakteri mengubah nitrat menjadi nitrit, umumnya dimiliki oleh golongan Pseudomonas (Reynolds 2009). Tabel 14 menunjukkan, isolat dengan kode MY 1, MY 6, MY 8, MY 9, MY 10, MY 12 dan MY FLR menunjukan kemampuan bakteri mengubah nitrat (merah) menjadi nitrit (kuning) yang ditandai dengan perubahan kondisi lingkungan dalam media (Gambar 15). Isolat MY 11 memperlihatkan perubahan kondisi lingkungan, tetapi tanpa disertai timbulnya gas, dan isolat MY 3 tidak menunjukkan perubahan. Gambar 15 Pengamatan uji reduksi nitrat. Tabel 14 Hasil uji reduksi nitrat MY 1 A (A): Larutan berubah asam MY 3 O (AG): Larutan berubah asam MY 6 AG disertai timbulnya gas MY 8 AG (O): Tidak menunjukkan MY 9 AG Perubahan MY 10 AG MY 11 A MY 12 AG MY FLR AG Berdasarkan hasil uji biokimia (Tabel 15), isolat bakteri MY 1, MY 3, MY 6, MY 8, MY 9, dan MY FLR diduga termasuk golongan Bacillus, kode MY 10 dan MY 11 termasuk Enterobacter, dan MY 12 Pseudomonas. Dugaan ini berdasarkan identifikasi bakteri teknik konvensional, yaitu membandingkan dengan bakteri yang telah diidentifikasi sebelumnya dalam Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Bagan alir identifikasi selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 7. Bila tidak terdapat bakteri yang ciricirinya 100% serupa, maka dilakukan pendekatan terhadap bakteri yang memiliki ciriciri paling menyerupai. Teknik identifikasi dengan metode konvensional ini akan selalu menghasilkan bakteri tertentu yang sudah teridentifikasi sebelumnya dan tidak dapat menemukan spesies baru (Cowan 1974 dalam Dwipayana & Herto 2004). Bakteri yang didentifikasi dari cemaran limbah minyak bumi kemungkinan besar turut berperan dalam proses degradasi limbah minyak bumi secara biologi. Penelitian Nugroho 2006, Saidi et al. (1999) dan Nababan (2008) mengidentifikasi bahwa isolat bakteri dari cemaran limbah minyak bumi merupakan genus Bacillus, Enterobacter dan Pseudomonas. Bakteri tersebut bertahan hidup dalam cemaran hidrokarbon dengan mendegradasi hidokarbon dalam limbah sebagai sumber karbon.