PERBANDINGAN METODE POTENSIOMETRI MENGGUNAKAN BIOSENSOR UREA DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UNTUK PENENTUAN UREA Abstrak Khairi Jurusan Kimia FMIPA Unsyiah Banda Aceh, 23111 Telah dilakukan analisis urea dalam larutan serum dengan metode potensiometri menggunakan biosensor urea berbasis membran kitosan. Hasil pengukuran dibandingkan dengan metode spektrofotometri. Pada metode potensiometri digunakan biosensor urea berbasis membran khitosan sebagai matriks immobilisasi urease pada elektroda ph. Elektroda tersebut digunakan untuk menentukan potensial larutan standar urea 10-1 10-8 M, dengan konsentrasi urea dalam larutan serum adalah 4 ppm. Konsentrasi larutan serum yang diperoleh pada metode potensiometri 4,28 ppm dan 4,08 ppm pada metode spektrofotometri. Hasil uji t antara kedua metode tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Kata Kunci: Potensiometri, Biosensor, Urea, Spektrofotometri. PENDAHULUAN Urea merupakan molekul dari amonia yang dibentuk pada proses deaminasi asam amino dalam hati. Menurut Dahliani (1995) bahan dasar urea adalah ammonia, karbondioksida dan kadar urea dalam darah orang dewasa adalah 1,8 4,0 mg/l. Jika kuantitas urea melebihi batas normal akan mengakibatkan tingginya kandungan urea dalam darah dan umumnya terjadi pada penderita gagal ginjal. Oleh karena itu sangat dibutuhkan analisis kandungan urea untuk keperluan diagnosa. Salah satu contoh analisis yang dapat dilakukan adalah penentuan kadar urea dalam larutan serum. Penentuan urea dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri dan potensiometri. Pada metode ini digunakan metode Berthelot untuk menentukan senyawa urea dalan larutan serum kontrol. Hasil hidrolisis urea dengan urease menghasilkan amonia dan karbondioksida. Ion amonium yang terbentuk bereaksi dengan hipoklorit dan salisilat membentuk larutan kuning 68 kehijau-hijauan yang dapat diukur secara spektrofotometri (Dahliani, 1995). Penentuan urea secara potensiometri dilakukan berdasarkan reaksi antara urea dengan urease membentuk amonium hiroksida (NH 4 OH). Elektroda ph merupakan sensor pada potensiometri yang digunakan untuk menentukan urea. Elektroda tersebut dilapisi dengan membran PVC (polivinilklorida) yang mengandung urease dengan sensitivitas 7 mv/dekade (Eggins, 1999). Senyawa NH 4 OH yang terdapat dalam larutan akan membentuk keseimbangan pada permukaan membran. Hal ini disebabkan oleh proses homogenasi dalam larutan untuk mencapai keseimbangan, dan selanjutnya dapat dijadikan dasar penentuan kuantitas urea dalam sampel. Perubahan nilai ph larutan dikonversikan dengan potensial dan sebanding dengan konsentrasi urea (Morf, 1991). Pada peralatan ini urease yang digunakan dalam keadaan terimmobilisasi dengan menggunakan sejumlah senyawa kimia sebagai
Perbandingan Metode Potensiometri Menggunakan Biosensor Urea dengan Spektrofotometri (Khairi) matriks untuk mengikat urease seperti PVC, khitosan, sedangkan glutaraldehid dan zat kimia lain berfungsi sebagai penyusun membran. Khitosan adalah matriks yang sangat baik untuk immobilisasi enzim dalam industri makanan karena zat tersebut tidak toksik, tersedia dalam berbagai bentuk (seperti gel, powder, fiber dan membran). Aktifitas khitosan terhadap enzim tinggi, banyak tersedia di alam dan harganya sangat murah (Spagna, 2002). Penelitian tentang pemanfaatan khitosan sebagai matriks immobilisasi telah dilakukan, diantaranya adalah biosensor fenol dengan menggunakan tirosinase yang diimmobilisasi dalam khitosan (Wang, 2002). Pada penelitian ini elektroda ph dilapisi oleh membran khitosan yang mengimmobilisasi urease. Selanjutnya alat ini digunakan untuk menentukan kadar urea pada larutan serum. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan metode spektrofotometri yang dianggap sebagai metode standar. BAHAN DAN METODA Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah urease tipe IX 66000 IU/g (sigma), urea (May dan Baker), khitosan (E. Merck), pereaksi I, pereaksi II, natrium hidroksida (E. Merck), asam klorida (E. Merck), asam asetat (E. Merck) dan serum (E. Merck). Metoda 1. Pembuatan membran khitosan Sebanyak 0,25 g khitosan dilarutkan dalam 2 ml asam asetat 1 %, diaduk dengan magnetik stirer dan ditambahkan 0,005 g urease. Elektroda ph dicelupkan ke dalam campuran khitosan, dikeringkan pada suhu ruang selama ± 2,5 jam, dan direndam dalam glutaraldehid 2,5 % selama 15 menit. Elektroda kemudian diangkat dan dikeringkan selama 4 jam (Eggins, 1999). 2. Pengukuran urea secara potensiometri Larutan standar urea disiapkan dengan konsentrasi 10-1 10-8 M. Masing-masing larutan diukur potensial elektrodanya. Potensial E (mv) terukur dialurkan terhadap konsentrasi, dan diukur potensial larutan serum kontrol menggunakan elektroda khitosan. Potensial larutan serum kontrol yang diperoleh diplotkan terhadap kurva kalibrasi larutan standar urea, sehingga dapat diketahui konsentrasi urea pada serum. 3. Pengukuran urea secara spektrofotometri Disiapkan sederetan larutan standar urea dengan konsentrasi 3-9 ppm, dan cara kerja metode spektrofotometri adalah: Tabel 1. Cara kerja penentuan serum kontrol dengan metode spektrofotometri Blanko Standar Sampel Standar - 30 μl - Serum (sampel) - - 30 μ L Pereaksi I + enzim 3 ml 3 ml 3 ml Dikocok dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang Pereaksi II 3 ml 3 ml 3 ml 69
Dikocok dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang Absorbansi standar dan sampel dibaca pada λ = 573-581 nm 4. Perbandingan hasil pengukuran Hasil pengukuran dari kedua metode diuji dengan menggunakan uji t. 20 0-2 0 y = -125,13 + 17,26 x R = 0,99911 HASIL DAN PEMBAHASAN Potensial (mv) -4 0-6 0-8 0 1. Penentuan Kadar Urea dengan Metode Potensiometri Metode immobilisasi enzim yang digunakan adalah metode cross linking dengan menggunakan pereaksi glutaraldehid. Metode cross linking antara khitosan dengan glutaraldehid berdasarkan pembentukan ikatan silang antara gugus fungsional amino dari polimer khitosan dengan gugus karbonil dari pereaksi glutaraldehid. Akibat adanya ikatan silang maka rantai polimer khitosan semakin rapat sehingga enzim semakin mudah untuk diimmobilisasi (Said, 1987). Biosensor dapat mengukur urea karena terjadinya hidrolisis dari urea yang dikatalitik oleh urease membentuk ammonium hidroksida. Senyawa tersebut di dalam air akan terhidrolisis menjadi ion ammonium dan ion hidroksida, dan konsentrasi urea yang digunakan adalah 10-1 - 10-8 M. Konsentrasi serum dengan metode potensiometri adalah adalah 4,28 ppm dengan simpangan baku 0,103. -100-120 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -log (urea) (M ) Gambar 1. Kurva kalibrasi larutan standar urea biosensor urea berbasis membran khitosan Sensitivitas biosensor urea menggunakan membran khitosan adalah 17,26 mv/dekade, dan nilai ini masih jauh dari nilai ideal yaitu 59,1 mv/dekade. Akan tetapi nilai ini masih lebih baik bila dibandingkan yang diperoleh Eggins (1999) yaitu 7 mv/dekade. Hal ini disebabkan kurang aktifnya urease dalam menghidrolisis urea, sehingga perbedaan potensial dari sederetan larutan standar tidak jauh berbeda. 2. Penentuan Kadar Urea dengan Spektrofotometri Penentuan senyawa urea dalam serum dilakukan pada konsentrasi 3 9 ppm. Larutan serum diukur pada panjang gelombang 578 nm, dan persamaan garis lurus yang diperoleh adalah y = - 1,57.10-3 + 6,79.10-3 x. Tabel 2. Uji keterulangan serum menggunakan biosensor urea berbasis membran khitosan No. Potensial (mv = y) Konsentrasi (pm = x) Konsentrasi (ppm = x) 1-52,51 4,20 3,78 2-53,4 4,15 4,25 3-53,57 4,14 4,35 4-54,44 4,09 4,88 5-53,4 4,15 4,25 6-53,4 4,15 4,25 7-53,4 4,15 4,25 x 29,03 30,01 x 4,15 4,28 70
Perbandingan Metode Potensiometri Menggunakan Biosensor Urea dengan Spektrofotometri (Khairi) Gambar 2 menunjukkan bahwa absorbansi larutan semakin meningkat dengan bertambahnya konsentrasi. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan absorbansi dan konsentrasi adalah berbanding lurus. Absorbansi 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 y = 1,57.10-3 + 6,79.10-3 x R = 0,99554 3 4 5 6 7 8 9 Konsentrasi (ppm) Gambar 2 Kurva kalibrasi larutan standar urea dengan metode spektrofotometri 3. Analisis Data Potensiometri dan Spektrofotometri Pada penelitian ini digunakan uji statistik (uji t) untuk membandingkan hasil penentuan kadar urea pada serum dari kedua metode tersebut, dengan konsentrasi serum adalah 4 ppm. Dari perhitungan diperoleh nilat t hitung sebesar -0,86 dan t tabel sebesar 2,18. Sehingga t hitung < t tabel, hal ini menunjukkan bahwa kedua metode tersebut tidak berbeda nyata (Suroso, 1991). Dengan demikian penentuan kadar urea dapat dilakukan dengan metode spektrofometri maupun potensiometri. Pada penelitian ini digunakan uji statistik (uji t) untuk membandingkan hasil penentuan kadar urea pada serum dari kedua metode tersebut, dengan konsentrasi serum adalah 4 ppm. Dari perhitungan diperoleh nilat t hitung sebesar -0,86 dan t tabel sebesar 2,18. Sehingga t hitung < t tabel, hal ini menunjukkan bahwa kedua metode tersebut tidak berbeda nyata (Suroso, 1991). Dengan demikian penentuan kadar urea dapat dilakukan dengan metode spektrofometri maupun potensiometri. KESIMPULAN Hasil penelitian ini menyimpulkan bahwa kadar urea yang terukur dengan metode potensiometri 4,28 ppm, sedangkan dengan metode spektrofotometri 4,08 ppm dan kadar serum sebenarnya adalah 4 ppm. Hasil uji t antara kedua metode tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Tabel 3. Uji keterulangan serum kontrol dengan metode spektrofotometri No Absorbansi (A = y) Konsentrasi (ppm = x) 1 0,0233 3,66 2 0,0207 3,28 3 0,0261 4,08 4 0,0318 4,91 5 0,0261 4,08 6 0,0261 4,08 7 0,0287 4,46 x 28,55 x 4,08 71
DAFTAR PUSTAKA Dahliani, R. A., 1995, Pengaruh Hemodialisis terhadap Kadar Ureum pada Penderita Gagal Ginjal di Bagian Instalasi Patologi Klinik Rumah Sakit Hasan Sadikin, Bandung. Eggins, B. R., 1999, Biosensors : an Introduction, John Wiley and Sons, New York. Morf, W.E., 1991, The Principles of Ion-Selective Electrodes and of Membrane Transport, Elsevier Scientific Publisihing Company, Amsterdam. Said, E.G., 1987, Bioindustri, Penerapan Teknologi Fermentasi, PT. Mediyatama Sarana Perkasa, Edisi Pertama, Jakarta. Spagna, G. Et al, 2002, A Mixture of Purified Glycosidase from Aspergillus niger for Oenological Application Immobilisd by Inclusion in Chitosan Gels, Enzyme and Microbial Technology, 30 (10) 80-89. Suroso, 1991, Statistika untuk Kimia Analitik, Terjemahan dari Statistical for Analytical Chemistry, oleh Miller, J. C. Dan Miller 72