29 LAMPIRAN Lampiran 1. Komposisi Media MGMK Padat dan Cara Pembuatannya Bahan: K 2 HPO 4 0,7 g KH 2 HPO 4 0,3 g M g SO 4. 7H 2 O 0,5 g FeSO 4.7H 2 O 0,01 g ZnSO 4 0,001 g MnCl 2 0,001 g Koloidal kitin 12,5% (b/v) 72,7 ml Agar 20 g ph 6,8 Cara pembuatan: Semua bahan dicampur dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi satu liter. Diatur ph sampai 6,8 dengan penambahan NaOH 0,1 N. Setelah dicapai ph yang diinginkan, medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121º C dengan tekanan 2 bar selama 15 menit.
30 Lampiran 2. Komposisi Media Cair Molase Tripton dan Cara Pembuatannya Bahan: Molase 12 g Tripton 1,8 g Mineral (Larutan garam) 10 ml Akuades 600ml Cara pembuatan: Semua bahan dicampur kemudian ditambakan akuades setelah itu media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC dengan tekanan 2 bar selama 15 menit.
31 Lampiran 3. Perbanyakan dan Pembuatan Suspensi Bacillus sp.bk17 Biakan Bakteri Dikultur dalam media MGMK selama 2 hari pada suhu 37 º C Diambil hasil subkultur menggunakan jarum ose Dimasukkan subkultur kedalam tabung yang berisi 10 ml akuades steril Dihomogenkan. Disamakan kekeruhannya dengan larutan standart Mac Farland 10 8 cfu/ml
32 Lampiran 4. Pertumbuhan dan Sporulasi Bacillus sp. BK17 Biakan Bakteri Ditumbuhkan subkultur dalam media cair molase + tripton dengan suhu 28ºC kemudian dishaker dengan kecepatan 100 rpm selama 3 hari (Belum dipublikasi: Rachmi, 2014) Dilakukan sporulasi dengan shock temperature yaitu 70ºC selama 60 menit (Belum dipublikasi Annisa, 2014) Diukur kepadatan sel dan spora dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm dan 660 nm
33 Lampiran 5. Pemanenan Spora Bacillus sp. BK17 Inokulum bakteri penghasil spora Disentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit Dicuci endapan biomassa sebanyak tiga kali secara serial dengan larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) Disentrifugasi 3000 rpm selama 20 menit, lalu supernatan dibuang Dicuci kembali endapan biomassa dengan PBS sebanyak 3 kali Diresuspensikan kembali dengan kekeruhannya yang sama dengan standart Mac Farland10 8 cfu/ml Dimasukkan kedalam bahan pembawa
34 Lampiran 6. Pencampuran Spora Bacillus sp. BK17 pada Berbagai Bahan Pembawa Suspensi spora Disebarkan secara merata dengan perbandingan 10 ml suspensi spora (standart Mac Farland 10 8 cfu/ml) untuk setiap 50 g bahan pembawa: talek, tapioka, kitosan dan tepung jagung Ditambahkan unsur mikro seperti Fe, Mg, Mn, Zn pada konsentrasi 5 ppm, kitin 0,5% dan yeast ekstrak 1% Dikeringanginkan dengan menyebarkan bahan pembawa di dalam loyang yang dilapisi alumunium foil. Proses ini dilakukan secara aseptisdi dalam laminar air flow dengan suhu 28ºC. Dibolak-balik dengan menggunakan spatula untuk memastikan bahwa keseluruhannya tercampur secara baik Dilakukan pengeringan didalam oven dengan menggunakan suhu 60 0 C selama ± 21 jam, sehingga kadar air campuran suspensi spora dan bahan pembawa mencapai ± 12% Disimpan bahan pembawa di dalam botol film yang dilapisi lakban hitam. Pada suhu ruang ditambahkan silica gel dalam kemasan yang telah dilapisi kertas saring agar terjaga kelembamannya.
35 Lampiran 7. Asai Viabilitas Bacillus sp. BK17 Pada Berbagai Bahan Pembawa Suspensi bakteri + Bahan Pembawa Disimpan campuran suspensi bakteri + bahan pembawa selama 1 bulan pada suhu kamar dan 4 0 C Ditumbuhkan dan diihitung jumlah koloni dengan menggunakan metode TPC (Total Plate Count) pada media PCA (Plate Count Agar) setiap minggu ke-0,1,2,3 dan 4 dengan masa inkubasi 36-48 jam.
36 Lampiran 8. Pewarnaan dan Pengamatan SporaBacillus sp. BK17 Inokulum bakteri Dioleskan pada kaca obyek yang telah dibersihkan dengan alkohol 70%, diberi 1-2 tetes akuades, disebarkan secara merata membentuk bujur sangkar Ditutup dengan kertas saring.teteskan 1-2 tetes malachite green selama 1 menit. Diletakkan preparat sediaan diatas water bath selama 5 menit Diangkat pelan-pelan kertas saring, kemudian preparat sediaan dibilas dengan akuades dan dikeringkan. Diberi safranin selama 30 detik- 60 detik. Dibilas preparat sediaan dengan akuades, lalu dikeringkan Pengamatan dan pengambilan gambar bakteri dilakukan dengan menggunakan mikroskop perbesaran 1000x
37 Lampiran 9. Gambar Dokumentasi Penelitian Gambar 9.1 Endapan biomassa Bacillus sp. BK17 Gambar 9.2 Moisture Balance Talek Tapioka Kitosan T. Jagung Gambar 9.3 Beberapa jenis bahan pembawa Talek Tapioka Kitosan T. Jagung Gambar 9.4 Tempat penyimpanan bahan pembawa