RATNA ANNISA UTAMI 10703022 AMPLIFIKASI DAN KLONING DNA PENGKODE PROTEIN CHAPERONIN 60.1 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KE DALAM VEKTOR pgem-t PADA ESCHERICHIA COLI PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007
Pada kutipan atau saduran skripsi ini harus tercantum nama penulis dan lembaganya yaitu Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
AMPLIFIKASI DAN KLONING DNA PENGKODE PROTEIN CHAPERONIN 60.1 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KE DALAM VEKTOR pgem-t PADA ESCHERICHIA COLI SKRIPSI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains dan Teknologi Farmasi dari Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung September 2007 Oleh Ratna Annisa Utami 10703022 Disetujui oleh Debbie Sofie Retnoningrum, Ph. D. Pembimbing Utama Ernawati A.Giri Rachman Ph.D Pembimbing Serta
ABSTRAK Telah diamplifikasi DNA pengkode protein chaperonin 60.1 Mycobacterium tuberculosis menggunakan metode reaksi polimerasi berantai (Polymerase Chain Reaction, PCR) dengan kromosom M. tuberculosis sebagai cetakan. Produk PCR berukuran 1643 pasangan basa (pb), diligasikan ke plasmid pgem-t rekombinan dan hasil ligasi ditransformasi ke Escherichia coli JM 109 untuk menghasilkan pgem-t rekombinan yang membawa DNA pengkode chaperonin 60.1. Analisis migrasi dan pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi BamHI dan EcoRI telah dilakukan terhadap pgem-t rekombinan. Hasil menunjukkan bahwa pgem-t rekombinan bergerak lebih lambat dibandingkan dengan pgem-t tanpa DNA sisipan. Pemotongan tunggal pgem-t rekombinan dengan BamHI atau EcoRI menghasilkan dua pola pemotongan yaitu plasmid berukuran 3503 pb dan plasmid tidak terpotong oleh kedua enzim restriksi. Plasmid dengan pola pertama adalah bukan plasmid membawa DNA pengkode chaperonin 60.1 dan plasmid yang tidak terpotong oleh BamHI atau EcoRI kemungkinan adalah plasmid yang mengandung DNA pengkode chaperonin 60.1 dan sedang dikarakterisasi lebih lanjut. i
ABSTRACT DNA encoding for chaperonin 60.1 protein of Mycobacterium tuberculosis had been amplified by polymerase chain reaction (PCR) using M. tuberculosis chromosome as template. The PCR product of 1643 base pairs (bps) in size was ligated into pgem-t cloning vector and ligation mixture was transformed into Escherichia coli JM 109 to produce recombinant, pgem-t carrying DNA fragment encoding for chaperonin 60.1. Migration analysis and cleavage using BamHI and EcoRI restriction enzymes were done to recombinant pgem-t. Results showed that recombinant pgem-t migrated slower than that of without insert DNA. Single cleavage analysis of recombinant pgem-t using BamHI or EcoRI produced two digestion patterns, plasmid of 3503 bps in size and plasmid that was not cut by both enzymes. Recombinant plasmid with first pattern was confirmed not to carry DNA fragment encoding for chaperonin 60.1 and plasmid with the second pattern probably contained DNA fragment encoding for chaperonin 60.1 and is further being characterized. ii
KATA PENGANTAR Syukur alhamdulillah dan segala puji hanyalah milik Allah SWT, berkat izin dan kehendak-nya, buku Tugas Akhir II hasil penelitian selama kurang lebih satu semester dapat diselesaikan. Buku ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan studi tingkat sarjana di Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. Buku ini dapat diwujudkan berkat bantuan banyak pihak, oleh karena itu diucapkan salam hormat kepada Debbie Sofie Retnoningrum Ph.D sebagai dosen pembimbing utama serta Ernawati A.Giri Rachman Ph.D sebagai dosen pembimbing serta, yang telah memberi masukan, kritikan, saran, arahan, dan bimbingan selama pengerjaan tugas akhir ini. Terima kasih juga kepada dr. Agnes Kwenang, Sp. Biok. dan Rosanna, M. Si. dari Fakultas Kedokteran Universitas Hassanudin Makassar atas kerjasama yang telah terjalin. Ucapan terima kasih juga kepada ayahanda dan ibunda tercinta yang senantiasa mendo akan, memberikan semangat dan motivasi, serta dukungan moril dan materil secara nyata. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada adik, sahabat dan teman-teman satu perjuangan atas segala kebaikan dan dorongan semangat selama ini, serta semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan dalam proses tugas akhir ini. Segala bentuk kritik dan saran mengenai buku ini sangat dibutuhkan demi kemajuan dan menjaga nilai-nilai luhur ilmu pengetahuan. Semoga buku ini dapat senantiasa memperkaya ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi kita semua. iii
DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK... KATA PENGANTAR... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... PENDAHULUAN... 1 BAB 1 TINJAUAN PUSTAKA 4 1.1 M.tuberculosis... 4 1.2 Tuberkulosis... 5 1.3 Perkembangan Vaksin Tuberkulosis... 7 1.4 Chaperonin 60... 9 2 METODE PENELITIAN... 11 3 PERCOBAAN... 12 3.1 Bahan... 12 3.2 Alat... 12 3.3 Mikroba... 13 3.4 Amplifikasi DNA Pengkode Chaperonin 60.1... 13 3.5 Pemurnian DNA Pengkode Chaperonin 60.1 Hasil PCR Menggunakan Kolom GFX TM... 15 3.6 Ligasi DNA Pengkode Chaperonin 60.1... 15 3.7 Transformasi pgem-t Rekombinan yang Mengandung DNA Pengkode Chaperonin 60.1 ke E.coli JM 109... 15 3.8 Karakterisasi pgem-t Rekombinan... 16 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN... 18 5 KESIMPULAN DAN SARAN... 25 5. 1 Kesimpulan... 25 5. 2 Saran... 25 6 RINGKASAN PENELITIAN... 26 7 DAFTAR PUSTAKA... 27 i iii v vi iv
DAFTAR TABEL Tabel Halaman 1.1 Vaksin Baru Untuk Penyakit Menular : Status Penelitian dan Pengembangannya, IVR, WHO, Februari 2006... 8 3.1 Variasi Kondisi dan Komposisi PCR... 14 3.2 Jumlah DNA yang Disisipkan Untuk Reaksi Ligasi... 15 4.1 Jumlah Koloni Hasil Transformasi dan Koloni Putih yang Mengandung Plasmid Rekombinan... 22 v
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 4.1 Hasil Optimasi Komposisi PCR..... 20 4.2 Analisa Migrasi Plasmid Rekombinan... 22 4.3 Hasil Analisis Karakterisasi Klon Menggunakan Enzim Restriksi (1)... 24 4.4 Hasil Analisis Karakterisasi Klon Menggunakan Enzim Restriksi (2)... 24 vi