BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Falerin (4,5-dihidroksi-5 -metoksibenzofenon-3-o-glukosida) adalah isolat dari buah mahkota dewa berkerangka benzofenon yang mempunyai aktivitas antiinflamasi. Penelitian biodistribusi senyawa falerin pada hewan percobaan dapat dilakukan dengan metode perunut (tracer) radioaktif, yaitu memanfaatkan falerin bertanda atom radioaktif untuk mempelajari perilaku falerin di dalam tubuh hewan percobaan serta akumulasinya. Falerin yang dilabel radionuklida Iodinium-131 ( 131 I + ) dapat disintesis melalui metode oksidasi kloramin-t. Sementara itu penambahan atau pengurangan atom pada struktur molekul dapat mengakibatkan terjadinya perubahan struktur dan sifat elektronik molekul, sehingga sifat fisiko-kimia yang berkaitan dengan interaksi biologi didalam tubuh akan berbeda antara falerin sebelum dan sesudah dilabel 131 I +. Kajian reaktifitas molekul falerin terhadap radionuklida 131 I + dan kemiripan struktur antara molekul falerin sebelum dan sesudah dilabel 131 I + dilakukan dengan menggunakan metode komputasi Austin Models 1 (AM1). Tahap pertama penelitian ini adalah penentuan konformasi molekul yang mempunyai energi global minimum. Penentuan konformasi ini menjadi penting karena pada keadaan energi tersebut, konformasi molekul ada dalam jumlah paling banyak. Sehingga dapat mewakili kemiripan molekul falerin yang dilabel 131 I + dengan senyawa induk, yakni konformasi moleku falerin yang mempunyai energi global minimum. Kajian reaktifitas molekul falerin dilakukan untuk mengetahui posisi serangan eletrofilik radionuklida 131 I + pada atom molekul falerin. Kajian yang dilakukan 17

18 meliputi reaktivitas molekul falerin pada keadaan energi global minimum. Reaktivitas molekul dianalisis menggunakan Teori Orbital Molekul Terdepan (Frontier Molecular Orbital Theory) dengan melihat parameter energi orbital molekul, muatan atom, kerapatan muatan total, dan potensial elektrostatiknya. Dua molekul dianggap mirip jika mirip secara struktur (bentuk) atau sifat elektroniknya. Kajian kemiripan struktur yang dilakukan meliputi (1) kemiripan secara geometri dengan parameter akar kuadrat rata-rata panjang ikatan, sudut ikatan, dan torsi dan (2) kemiripan secara elektronik yang menentukan sifat fisikokimia senyawa dengan parameter kontur kerapatan muatan total. 4.1 Pembangunan Model dan Optimasi Molekul Falerin Terhadap Struktur model molekul tiga dimensi falerin yang dibangun dengan menggunakan Drawing Tools dan Model Builder, dilakukan optimasi agar diperoleh konfigurasi molekul yang mempunyai energi minimum. Perhitungan energi optimasi geometri molekul falerin menghasilkan energi panas pembentukan ( H f ) sebesar -380,067 kkal/mol. 4.2 Penentuan Energi Global Minimum Molekul Falerin Molekul akan terus bergerak dengan mengubah konformasinya menuju konformasi molekul yang memiliki energi paling minimum. Energi global minimum adalah energi molekul yang menunjukkan kestabilan molekul dan batas pemutusan ikatan. Hasil perhitungan optimasi geometri dengan hyperchem tidak menjamin dapat menghasilkan konfigurasi molekul yang mempunyai energi global minimum. Analisis konformasi molekul dilakukan untuk mendapatkan konfigurasi molekul yang menunjukkan energi paling minimumnya (energi global minimum) dengan metode Raman plot. Metode ini dilakukan dengan memvariasikan secara sistematis torsi molekul yang mewakili rotasi dari molekul untuk menghasilkan atau menggambarkan semua kemungkinan konformasi molekul. Variasi torsi yang

19 digunakan dari -180 sampai +180 dengan perputaran torsi 10 disetiap perubahan variasi torsi. Molekul falerin mempunyai sembilan pusat stereogenik, yaitu atom C-3, C-6, C-7, C-8, C-16, C-18, C-19, O-12, dan O-47 (Gambar 4.1). Pada kajian yang dilakukan ditentukan lima dari sembilan pusat stereogenik yang digunakan untuk analisis konformasi molekul, yaitu: C-7, C-8, C-18, C-19, dan O-12. Pusat stereogenik di atom O-47 dan C-16 tidak disertakan dalam analisis energi konformasi molekul karena pusat stereogenik tersebut adalah gugus metoksi yang pengaruhnya terhadap energi konformasi molekul dapat dianggap kecil. Hasil perhitungan dengan menggunakan program Hyperchem (versi 7.51), perhitungan semiempirik, metode AM1, diketahui bahwa konformasi dengan energi paling minimum terdapat pada molekul dengan ΔH f -380,1216024 kkal/mol, T 1a (C-6, C-7, C-8, C-13) = -150º dan T 2b - (C-3, C-12, C-18, C-19) = -120º. Nilai ΔH f global minimum dapat dikatakan sama dengan ΔH f minimum kelompok variasi torsi tetapi konformasinya berbeda. Hal ini dapat dijelaskan karena perputaran torsi 10 disetiap perubahan variasi torsi bisa jadi terlalu besar untuk molekul falerin, sehingga tidak terlihat jelas perbedaannya. Gambar 4.1 Molekul falerin

20 Tabel 4.1 Gambar Grafik Hf Terhadap Variasi Torsi No. Grafik Hf Terhadap No. Variasi Torsi 1 4 Grafik Hf Terhadap Variasi Torsi 2 5 3 6 Tabel 4.2 Energi Panas Pembentukan (ΔH f ) Minimum Molekul Falerin pada Kelompok Variasi Torsi Kelompok ΔH T Torsi 1a T 1b T 2a T 2b T f 2c (kkal/mol) 1 30 º 140 º -380,052 2 30 º -120 º -380,093 3 30 º 80 º -380,043 4-150 º 140 º -380,082 5-150 º -120 º -380,122 6-150 º 80 º -380,106 7-150,68 º 31,92 º 129,57 º -139,09 º 87,8 º -380,066 Keterangan: T 1a (C-6, C-7, C-8, C-13); T 2a (C-1, C-3, C-12, C-18); T 1b (C-5, C-6, C-7, C-8); T 2b (C-3, C-12, C1-8, C19) ; T 2c (C-12, C-18, C-19, C-24); ΔH f adalah Energi panas pembentukan; Konformasi molekul No. 7 adalah konformasi molekul hasil optimasi geometri.

21 4.3 Penentuan Reaktivitas Molekul Falerin Reaktivitas molekul dapat dianalisis menggunakan teori orbital molekul terdepan (Frontier Molecular Orbital Theory) dengan parameter energi orbital molekul, muatan atom, kerapatan muaatan total, dan potensial elektrostatik. 4.3.1 Muatan atom dan kerapatan muatan total Kerapatan muatan total menggambarkan distribusi muatan elektron pada molekul, sedangkan distribusi muatan elektron dinyatakan sebagai muatan atom. Kerapatan muatan elektron yang tinggi menunjukkan bahwa lokasi tersebut rentan terhadap serangan elektrofilik. Hasil perhitungan menunjukkan muatan atom C-17 (-0,219) paling negatif di antara atom C yang lain (Tabel 4.3) dan muatan atom O-27 (-0,338) paling negatif di antara atom O yang lain (Tabel 4.4). Pada Gambar 4.3. terlihat bahwa kontur kerapatan muatan total paling tinggi ada pada atom O-27 dan O-9 yang digambarkan dengan kerapatan kontur tinggi. Atom O-9 mempunyai kontur kerapatan muatan total tinggi karena atom O-9 adalah penarik elektron dan juga adanya migrasi elektron dari sistem resonansi yang mengikat metoksi, menyebabkan di atom O-9 terdistribusi lebih banyak elektron yang dinyatakan dengan muatan atom yang lebih negatif. Dari keterangan gambar dapat dikatakan bahwa daerah atom O-27 dan O-9 lebih rentan terhadap serangan elektrofilik. Akan tetapi tidak akan terbentuk ikatan antara radionuklida 131 I + dengan atom O karena ikatan yang terbentuk terlalu lemah. Ikatan yang paling memungkinkan terjadi antara radionuklida 131 I + adalah dengan atom karbon bermuatan negatif dan dari data diperoleh bahwa atom karbon yang kerapatan muatan total paling tinggi adalah C-4, C-15, dan C-17 (Gambar 4.2). Sedangkan serangan elektrofilik di atom C-5 tidak dimungkinkan karena adanya halangan sterik dari glukosa yang terikat di atom C-3. Begitu pula serangan

22 elektrofilik di atom C-8 tidak dimungkinkan karena adanya sistem resonansi yang stabil sehingga tidak dimungkinkan terjadi pemutusan ikatan pada atom C-8. Tabel 4.3 Muatan Atom C Paling Negatif Molekul Falerin Muatan Atom C Falerin Konformasi Molekul C-4 C-5 C-8 C-15 C-17 Setelah Global minimum -0,149-0,118-0,187-0,171-0,219 Tabel 4.4 Muatan Atom O Molekul Falerin Konformasi Muatan Atom O Falerin Molekul O-9 O-10 O-11 O-20 O-27 O-47 Setelah Global minimum -0,296-0,227-0,222-0,272-0,338-0,206 Kontur Kerapatan Muatan Total Muatan Atom Gambar 4.2 Kerapatan Muatan Total dan Muatan Atom Molekul Falerin setelah Global Minimum 4.3.2 Potensial elektrostatik Potensial elektrostatik menunjukkan energi potensial pada tiap titik dalam ruang akibat distribusi muatan atom. Potensial elektrostatik yang negatif akan menolak ion muatan negatif dan menarik ion muatan positif dan berlaku untuk sebaliknya. Pada Gambar 4.3 daerah potensial elektrostatik negatif ditunjukkan pada daerah atom O-9, O-10, O-11, O-27, O-20, dan O-47. Daerah potensial elektrostatik negatif dominan di daerah atom O-10, O-11, dan O-9 karena atom C-3 yang berikatan dengan glukosa adalah pendorong elektron dan atom O-9 adalah penarik

23 elektron. Berdasarkan hal tersebut maka dimungkinkan radionuklida 131 I + akan tertarik pada daerah tersebut, tetapi karena ikatan radionuklida 131 I + dengan oksigen sangat lemah maka kemungkinan masuk radionuklida pada atom O tidak mungkin terjadi. Kontur Potensial Elektrostatik Potensial Elektrostatik Tiga Dimensi Potensial elektrostatik negatif: kontur violet Potensial elektrostatik positif : kontur hijau Gambar 4.3 Potensial Elektrostatik Molekul Falerin Potensial elektrostatik negatif: violet Potensial elektrostatik positif : hijau 4.3.3 Orbital molekul Orbital molekul berhubungan dengan distribusi elektron dan menunjukkan probabilitas untuk menemukan elektron. Tiap orbital molekul mempunyai energi yang khas. Energi tersebut digambarkan sebagai nilai orbital molekul. Nilai energi orbital molekul besar menunjukkan kerentanannya terhadap serangan elektrofilik. Sementara serangan elektrofilik berhubungan dengan atom yang mempunyai orbital HOMO berkerapatan tinggi karena distribusi terbanyak elektron ditunjukkan oleh orbital HOMO. Dari hasil perhitungan energi orbital atom molekul falerin (Tabel 4.5) menunjukkan perbedaan energi orbital yang hampir sama pada atom sejenis. Sementara itu energi orbital atom O sedikit lebih besar dibandingkan dengan energi orbital atom C. Berdasarkan nilai energi orbital atom dan kontur HOMO yang rapat pada atom molekul falerin maka atom O-9, O-10, dan O-11 lebih rentan terhadap serangan

24 elektrofilik, dibandingkan atom C. Akan tetapi ikatan antara 131 I + dan atom oksigen adalah ikatan kovalen koordinasi yang lemah sehingga tidak akan terbentuk molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom O. Sehingga serangan elektrofilik paling mungkin terjadi di atom C-4, C-15, dan C-17. Berdasarkan pada parameter nilai energi orbital atom yang tidak dapat dibedakan antar ketiga atom C tersebut, maka reaktivitas senyawa falerin terhadap 131 I + hanya berdasarkan muatan atom. Tabel 4.5 Energi Orbital Atom C dan Atom O Molekul Falerin Molekul Energi Orbital Atom C Falerin C-4 C-14 C-17 S 1,219 1,217 1,216 Px 1,02 0,945 1,092 Py 0,937 0,934 0,949 Pz 0,973 0,966 0,961 Molekul Energi Orbital Atom O Falerin O-9 O-10 O-11 S 1,913 1,864 1,862 Px 1,387 1,645 1,538 Py 1,692 1,23 1,399 Pz 1,305 1,488 1,424 Kontur Dua Dimensi Orbital HOMO Tiga Dimensi Orbital HOMO Orbital HOMO: kontur violet Orbital HOMO: biru Orbital LUMO: kontur hijau Orbital LUMO: hijau Gambar 4.4 Orbital HOMO molekul falerin

25 4.4 Penentuan Kemiripan Molekul Falerin yang dilabel Radionuklida 131 I + terhadap Molekul Induk Dua molekul dianggap mirip jika mirip secara bentuk atau sifat elektroniknya. Jika tidak, maka dua molekul dianggap mirip jika mempunyai farmakofor pada posisi yang sama. Sedangkan dalam kimia molekul dikatakan mirip jika mempunyai sifat yang sama dan merupakan dasar hubungan empiris antara struktur dan aktivitas. 4.4.1 Kemiripan struktur Telah dilakukan kajian kemiripan molekul antara molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + dengan molekul induk (konformasi molekul falerin yang mempunyai energi global minimum). Pada kajian ini dilakukan metode RMS fit dan overlay antara molekul induk dengan molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-4, C-15, C-17, (C-15 dan C-17), (C-4dan C-17), (C-4 dan C-15), dan (C-4, C-15, dan C-17). Metode RMS fit dan overlay dilakukan untuk membandingkan secara visual dua molekul secara geometri, sehingga diketahui secara sekilas kemiripan kedua molekul tersebut. Pada metode ini dilakukan pertumpang tindihan molekul induk dengan molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + sehingga didapatkan dua molekul saling tumpang tindih yang mempunyai jarak antar atom molekul paling minimum. Nilai akar kuadrat rata-rata dihitung terhadap jarak antar atom molekul. Berdasarkan hasil perhitungan diketahui bahwa molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + pada atom C-17 lebih mirip dibandingkan dengan molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + pada atom C lainnya dengan nilai RMS fit paling kecil, yaitu: 0,745 A (Tabel 4.6).

26 Tabel 4.6 Nilai RMS Fit dan Gambar Overlay Molekul Falerin dengan Falerin Yang Dilabel 131 I + Overlay Gambar overlay Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-4 RMS: 2,899 A Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-15 RMS: 2,027 A Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-17 RMS: 0,745 Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-15 dan C-17 RMS: 2,099 A Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-4 dan C-17 RMS: 3,036 A

27 Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-4 dan C-15 RMS: 3,681 A Molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-4, C-15, dan C-17 RMS: 3.655 A Dari hasil tersebut dilanjutkan dengan perhitungan akar kuadrat rata-rata dari panjang ikatan, sudut ikatan, dan torsi molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-15, C-17, dan (C-17; C-15), yang dilakukan untuk memastikan kemiripan secara struktur. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa senyawa falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-17 paling mirip dibandingkan molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-4, C-15, dan (C-17; C-15) dengan nilai akar kuadrat rata-rata panjang ikatan (0,0021), sudut ikatan (0,4185), dan torsi (2,9074) (Tabel 4.7). Tabel 4.7 Kemiripan Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + terhadap Senyawa Induk Akar Kuadrat Falerin yang Dilabel dengan 131 I + pada Atom C Rata-rata C-4 C-15 C-17 C-15 dan C-17 Panjang ikatan 0,0029 А 0,0018 0,0021 0,0029 Sudut ikatan 1,1605 А 0,2837 0,4185 6,2563 Torsi 68,727 А 13,5338 2,9074 29,5207 4.4.2 Kemiripan elektronik Pada gambar 4.5 menunjukkan kontur kerapatan muatan total falerin sesudah dilabel pada atom C-4, C-15, C-17, dan (C-15 dan C-17), tampak berbeda dengan kontur kerapatan muatan total molekul induk. Pada molekul induk terdapat kontur kerapatan muatan total tinggi di atom O-27 dan O-9, sedangkan atom lainnya

28 digambarkan dengan kontur kerapatan muatan yang hampir merata di kerangka benzofenon. Kontur kerapatan muatan total falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-17 menunjukkan kerapatan muatan total yang tinggi di atom O-9, O-12, O-20, dan O- 47 dan atom lainnya kontur kerapatan muatan totalnya merata. Sedangkan kontur kerapatan muatan total molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-4 menunjukkan kontur kerapatan muatan total yang tinggi di atom O-10, O-11, O- 20, dan O-26, sedangkan atom lainnya kontur kerapatan muatan totalnya merata. Kontur kerapatan muatan total falerin yang dilabel radionuklida 131 I + dia atom C- 15 menunjukkan kontur kerapatan muatan total yang tinggi di atom O-9, O-11, O- 25, dan O-27, sedangkan atom lainnya digambarkan dengan kontur rendah. Sementara itu kontur kerapatan muatan total falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom (C-15 dan C-17) menunjukkan kerapatan yang tinggi di atom O-27, sedangkan atom lainnya kontur kerapatan muatan totalnya merata. Perbedaan kontur kerapatan pada masing-masing molekul falerin sebelum dan sesudah dilabel 131 I + dikarenakan perubahan konformasi molekul yang diakibatan perbedaan posisi subtitusi 131 I +. Dari ke empat molekul falerin yang dilabel 131 I + dapat dikatakan bahwa kontur kerapatan muatan total molekul falerin yang dilabel 131 I + pada atom C-4 lebih berbeda dibandingkan terhadap molekul induk. Konformasi Molekul Induk Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + di C-17

29 Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + di C-4 Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + di C-15 Dan C-17 Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + di C-15 Gambar 4.5 Kontur Kerapatan Muatan Total Molekul Falerin dan Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + 4.4.3 Stabilitas molekul falerin yang dilabel Senyawa falerin yang diinginkan tidak hanya mirip tetapi juga stabil secara termodinamik sehingga tidak akan terjadi penguraian senyawa. Hasil perhitungan Hf molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + pada atom C yang berbeda menunjukkan bahwa molekul falerin yang dilabel sekaligus dengan dua radionuklida 131 I + pada atom (C-15 dan C17) menunjukkan kestabilan yang kurang baik dibandingkan dengan molekul falerin yang dilabel hanya dengan satu radionuklida 131 I + pada masing-masing atom C-4, C-15, dan C-17 dengan Hf - 337,224 kkal/mol. Tabel 4.7 Energi Panas Pembentukan Rata-rata ( H f ) Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + Falerin yang dilabel 131 I + pada atom C Energi panas pembentukan rata-rata (kkal/mol) 17-357,798 15-360,364

30 4-357,973 15 dan 17-337,224 4.5 Penentuan Sifat Fisiko-Kimia Sifat elektronik molekul adalah faktor penentu sifat fisiko-kimianya. Pada hasil perhitungan analisis sifat fisiko-kimia antara molekul induk dengan molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom C-4, C-15, dan C-17 menunjukkan peningkatan nilai polarisabilitas molekul dan refraktivitas molar. Sementara itu nilai log P menunjukkan sedikit penurunan yang menunjukkan molekul lebih lipofil. Surface area yaitu luas permukaan molekul yang kontak dengan pelarut, menunjukkan peningkatan pada molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + pada atom C-4, C-15, dan C-17 terhadap molekul induk karena adanya subtitusi atom hidrogen dengan radionuklida 131 I + yang mempunyai ukuran atom lebih besar dan menyebabkan perubahan konformasi molekul. Sifat fisikokimia molekul falerin yang dilabel radionuklida 131 I + di atom (C-15 dan C17) menunjukkan perbedaan terhadap molekul induk dan molekul falerin yang dilabel 131 I + di atom C-4, C-15, dan C-17 dengan nilai polarisabilitas, refraktivitas molar, dan surface area lebih besar dan log P yang lebih kecil. Nilai log P yang lebih kecil akan tampak jelas pengaruhnya terhadap biodistribusi falerin, yaitu molekul falerin yang dilabel 131 I + akan terdistribusi lebih cepat ke organ atau jaringan dimana membran atau barier yang dilewati bersifat lipofil. Tabel 4.8 Parameter Fisiko-Kimia Senyawa Falerin Dan Falerin Yang Dilabel 131 I + Molekul Falerin yang Dilabel 131 I + Parameter Fisiko-kimia Molekul Induk di Atom C 4 15 17 15 dan 17 Polarisabilitas 39,82 ų 44,85 ų 44.85 ų 44,85 ų 49.88 ų Refraktivitas molar 108,44 ų 120,76 ų 120.76 ų 120,76 ų 133.08 ų Log p -2, 85-2,34-2.34-2,34-1.82 Surface area 629,47 Å 2 673,88 Å 2 663.22 Å 2 663,22 Å 2 697.7 Å 2