17 3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian Produksi dan Karakterisasi Enzim Transglutaminase dari Streptoverticillium ladakanum dengan Media yang Disubstitusi Limbah Cair Surimi dilaksanakan pada bulan Maret sampai Oktober 2009 bertempat di Laboratorium Bioteknologi, Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan. 3.2. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : peralatan gelas (tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala), timbangan analitik, sentrifus merk Beckman coulter, spektrofotometer, autoklaf, oven, sudip, jarum ose, laminar, kompor listrik, shaking inkubator, mikropipet, blue tip, eppendorf, bunsen, kertas ph, hot plate stirer dan termoblock. Bahan yang digunakan antara lain : (1) isolat bakteri Streptoverticillium ladakanum; (2) media untuk penyegaran isolat bakteri adalah ekstrak khamir, pepton, MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4, NaHPO 4 dan bacto agar ; (3) media inokulasi adalah ekstrak khamir, pepton, MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4, NaHPO 4, gliserol, aquades, sodium kaseinat dan limbah cair surimi yang diambil pada tahap pencucian I dan II (yang dicampur) dan berasal dari PT Namyong, Tegal; (4) uji aktivitas enzim adalah CBZ-gln-gly (benzyloxycarbonyl-l-glutaminyl-glycine), 0,2 N NaOH, 1,0 N NaOH, Tris-HCl ph 6, hydroxylamine, glutathione, 3 N HCl, 12% TCA, 5% FeCl 3.6H 2 O, miliq water; serta (5) analisis protein adalah Na 2 CO 3, 0,5 M NaOH, C 4 H 4 KNaO 6.4H 2 O, miliq water, CuSO 4.5H 2 O dan folin. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan yang terdiri dari optimasi media enzim transglutaminase dari bakteri Streptoverticillium ladakanum dengan memanfaatkan limbah cair surimi sebagai substrat. Media yang menghasilkan aktivitas enzim transglutaminase paling baik akan terpilih untuk dikarakterisasi dan diteliti lebih lanjut pada penelitian utama. Penelitian utama terdiri dari penentuan ph dan suhu optimum untuk aktivitas enzim,
18 ketahanan enzim terhadap panas, serta pengaruh ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase. 3.3.1 Penelitian pendahuluan Pada penelitian pendahuluan dilakukan substitusi media enzim transglutaminase dari bakteri Streptoverticillium ladakanum dengan memanfaatkan limbah cair surimi sebagai substrat. Penelitian ini meliputi penentuan waktu propagasi dan penentuan konsentrasi optimum limbah cair surimi dalam produksi enzim transglutaminase. Streptoverticillium ladakanum Kultur isolat bakteri pada media agar miring Pembuatan inokulum pada media cair Media standar / kontrol : - Ekstrak khamir 0,25% - Pepton 1,05% - MgSO 4. 7H 2 O 0,05% - KH 2 PO 4 0,2% - NaHPO 4 0,5% - Gliserol 5% - Sodium kasein 2% Produksi enzim pada media lokal dan standar Inkubasi dalam inkubator goyang 26 o C; 150 rpm; 8 hari Sampling dan pemisahan enzim dengan pellet menggunakan sentrifugasi 4 o C; 800 rpm; 30 detik -Uji aktivitas enzim -Uji protein terlarut (metode Lowry) Media lokal : - Ekstrak khamir 0,25% - Pepton 1,05% - MgSO 4. 7H 2 O 0,05% - KH 2 PO 4 0,2% - NaHPO 4 0,5% - Gliserol 5% - Limbah surimi (25, 50, 75,dan 100)% (v/v) Gambar 5. Diagram alir produksi enzim transglutaminase pada media lokal (limbah surimi) dan standar (modifikasi dari Tellez Luis et al., 2004) 3.3.1.1 Penentuan waktu propagasi (modifikasi dari Tellez Luis et al., 2004) Tujuan kegiatan ini adalah untuk mengetahui waktu yang tepat untuk memindahkan isolat ke dalam media produksi. Waktu propagasi diukur dengan menggunakan metode biomassa, yaitu mengukur berat biomassa sel kering menggunakan timbangan digital. Kegiatan ini dimulai dengan menumbuhkan isolat dalam beberapa erlenmeyer 25 ml yang berisi 20 ml media cair (Tabel 4). Isolat diinkubasi pada inkubator goyang dengan kecepatan agitasi 150 rpm dan suhu 26 o C selama waktu tertentu. Pengamatan dilakukan setiap 12 jam dengan menyaring sampel dalam erlenmeyer menggunakan kertas saring. Sebelumnya,
19 kertas saring ditimbang untuk mengetahui beratnya. Sampel tersebut dikeringkan terlebih dulu dalam oven (105 o C) selama 15 menit kemudian ditimbang beratnya. Biomassa sel tersebut selanjutnya diplotkan untuk memperoleh kurva pertumbuhan. Waktu propagasi ditentukan berdasarkan bentuk kurva yang dihasilkan. Rumus untuk memperoleh biomassa bakteri adalah sebagai berikut : Biomassa = (berat biomassa bakteri+berat kertas saring) berat kertas saring Tabel 4. Komposisi media inokulum Komposisi media Konsentrasi media (%) Ekstrak khamir 0,25 Pepton 1,05 MgSO 4.7H 2 O 0,05 KH 2 PO 4 0,2 NaHPO 4 0,5 Gliserol 5 Sodium kasein 2 3.3.1.2 Penentuan konsentrasi limbah cair surimi optimum (modifikasi dari Tellez Luis et al., 2004) Isolat hasil penyegaran dibiakkan dalam media inokulum sebanyak 10% dari total media produksi. Inokulum dimasukkan secara aseptik sebanyak 10% pada media kontrol dan media yang disubstitusi limbah cair surimi (Tabel 5). Inokulum dimasukkan ke dalam media tersebut pada waktu propagasi optimalnya dan diinkubasi pada shaking inkubator dengan kecepatan agitasi 150 rpm dan suhu 26 o C selama delapan hari. Setiap hari dilakukan pengambilan 2 ml sampel kultur untuk pengujian aktivitas enzim dan pengukuran konsentrasi protein. Waktu dan media optimal produksi enzim ditentukan dengan melihat nilai aktivitas enzim dan jumlah protein yang dihasilkan oleh kultur bakteri (seperti pada Gambar 5). Tabel 5. Komposisi media produksi enzim Komposisi media Media K Media A Media B Media C Media D Ekstrak khamir (%) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Pepton (%) 1,05 1,05 1,05 1,05 1,05 MgSO 4.7H 2 O (%) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 KH 2 PO 4 (%) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 NaHPO 4 (%) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Gliserol (%) 5 5 5 5 5 Sodium kaseinat (%) 2 - - - - Limbah cair surimi (%) (v/v) - 25 - - - Limbah cair surimi (%) (v/v) - - 50 - - Limbah cair surimi (%) (v/v) - - - 75 Limbah cair surimi (%) (v/v) - - - - 100
20 Keterangan: K = media kontrol A = media yang disubstitusi limbah cair surimi 25% (v/v) B = media yang disubstitusi limbah cair surimi 50% (v/v) C = media yang disubstitusi limbah cair surimi 75% (v/v) D = media yang disubstitusi limbah cair surimi 100% (v/v) 3.3.2 Penelitian utama Penelitian utama merupakan penelitian lanjutan dari hasil substitusi media enzim transglutaminase yang telah disubstitusi dengan memanfaatkan limbah cair surimi pada penelitian pendahuluan. Penelitian utama dilakukan untuk mengkarakterisasi enzim yang dihasilkan pada media bahan lokal yang memiliki aktivitas enzim transglutaminase paling baik. Karakterisasi enzim bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim sehingga penggunaan enzim dapat disesuaikan dengan karakter tersebut. Dengan penggunaan enzim pada kondisi optimumnya, maka enzim akan bekerja secara optimal dan lebih efisien. Karakterisasi enzim yang dilakukan pada penelitian ini adalah penentuan suhu optimum, ph optimum, ketahanan terhadap panas, pengaruh ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase serta penentuan bobot molekul protein dengan menggunakan metode SDS-PAGE. 3.3.2.1 Penentuan ph dan suhu optimum aktivitas enzim (Worratao dan Yongsawatdigul, 2005) Optimasi ph dan suhu dilakukan terhadap enzim transglutaminase hasil produksi menggunakan medium produksi hasil optimasi. Ekstrak enzim kasar diperoleh melalui sentrifugasi larutan fermentasi dengan kecepatan 5800 g pada suhu 4 o C selama 15 menit. Penentuan ph optimum dilakukan dengan mereaksikan enzim kasar pada bufer dengan variasi nilai ph yang berkisar antara 4 sampai 9. Bufer yang digunakan dalam penentuan ph optimum adalah 200 mm bufer asetat (ph 4 6), 200 mm bufer Tris HCl (ph 6 8) dan 200 mm bufer borat (ph 8 9), kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit. Pengaruh suhu pada aktivitas enzim transglutaminase ditentukan dengan menginkubasi enzim pada suhu 25, 30, 37, 50, 60, dan 70 o C selama 10 menit kemudian diukur aktivitasnya menggunakan ph optimum. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim tersebut dengan metode Grossowicz et al., (1950).
21 3.3.2.2 Penentuan ketahanan enzim terhadap panas (Singh dan Mehta, 1994) Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui waktu yang diperlukan enzim untuk kehilangan aktivitasnya. Pengujian dilakukan dengan memanaskan enzim tanpa substrat pada suhu 37, 50 dan 60 o C selama waktu tertentu. Setiap 20 menit enzim yang telah dipanaskan tersebut diangkat dan didinginkan beberapa menit. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim dengan metode Grossowicz et al., (1950). 3.3.2.3 Penentuan pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim (Lin et al., 2008) Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim transglutaminase diukur dengan mereaksikan enzim dengan 1 mm ion logam. Aktivitas diukur pada kondisi optimum enzim, dan dibandingkan dengan kontrol. Pada kondisi yang sama, dibuat kontrol yang tidak ditambahkan dengan ion logam. Ion logam yang diujikan meliputi kation Na +, K +, Li +,Cu +, Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+ dan Fe 3+ dalam bentuk larutan klorida. Hasil reaksi diuji aktivitasnya dengan metode Grossowicz et al., (1950). 3.3.2.4 Penentuan pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim (Suzuki et al., 2000) Pengaruh penambahan inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase diukur dengan mereaksikan enzim dengan dua konsentrasi inhibitor, yaitu 1 mm dan 5 mm. Aktivitas enzim diukur pada ph dan suhu optimal enzim, kemudian dibandingkan dengan kontrol. Pada waktu yang bersamaan, dibuat kontrol yang tidak ditambahkan inhibitor. Inhibitor yang digunakan, yaitu EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) dan PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride). Reaksi yang dihasilkan diuji aktivitasnya dengan metode Grossowicz et al., (1950). 3.3.2.5 Elektroforesis enzim transglutaminase dengan SDS-PAGE (Edelstein dan Bollag, 1991). Persiapan awal yang perlu dilakukan dalam elektroforeis adalah pembuatan gel. Metode yang digunakan dalam pembuatan gel adalah metode
22 Edelstein dan Bollag (1991). Komposisi gel SDS-PAGE dapat dilihat pada Tabel 6. Bahan untuk separating gel dicampur satu persatu dengan memasukkan 10% APS (ammonium persulfate) dan TEMED (Tetramethyl ethylenediamine) pada akhir campuran. Larutan tersebut diaduk dan dipipet perlahan ke dalam plate kaca sampai 1,5 cm dari permukaan kaca lalu didiamkan sekitar 15-20 menit. Dalam proses ini, diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Setelah gel memadat, campuran stacking gel dipipet perlahan ke dalam plate kaca lalu dengan segera dimasukan sisir (10 sumur) sebagai tempat memasukkan sampel. Komposisi gel SDS-PAGE dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. Komposisi gel SDS-PAGE Bahan Separating gel (12%) Stacking gel (5%) Larutan A 4 ml 0,67 ml Larutsn B 2,5 ml - Larutsn C - 1,0 ml Akuabides 3,5 ml 2,3 ml 10% APS 50 µl 30 µl TEMED 5 µl 5 µl Sampel yang telah dicampur dengan 5 x bufer sampel (45 µl + 5 µl) dipanaskan pada 100 o C selama 3 menit, lalu dilakukan loading sampel ke dalam sumur sebanyak 10 µl. Berbeda halnya dengan sampel, marker yang di-loading ke dalam sumur sebanyak 7,5 µl. Sebelum running dilakukan, buffer elektroforesis dimaskukan ke dalam chamber. Running elektroforesis dilakukan pada 125 volt, 16 ma dalam kondisi dingin. Waktu yang diperlukan untuk running elektroforesis sekitar 2 jam. Setelah pemisahan, gel dilepas dari plate kaca lalu direndam dalam larutan coomassie gel stain selama 7-10 menit. Setelah direndam, gel dibilas cepat dengan akuabides selama 2 x 20 detik. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan coomassie gel destain sampai diperoleh pita-pita protein yang jelas teramati dengan latar belakang relatif jernih. Gel direndam dalam larutan coomassie gel destain selama satu malam.
23 3.3.3 Prosedur analisis Analisis-analisis yang digunakan pada penelitian ini meliputi pengukuran aktivitas enzim transglutaminase dengan metode Grossowicz et al., (1950) dan uji protein dengan metode Lowry. 3.3.3.1 Uji aktivitas enzim (Grossowicz et al., 1950) Aktivitas enzim transglutaminase diukur dengan metode Grossowicz et al., (1950) yang telah dimodifikasi dengan menggunakan L-glutamic acid γ-monohydroxamate sebagai standar. Satu unit transglutaminase didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang mengkatalisis pembentukan 1 µmol L-glutamic acid γ-monohydroxamate per menit pada suhu 37 o C.. Dua eppendorf disiapkan untuk sampel enzim dan blanko. Reagen A dibuat lebih dulu dengan cara menghomogenkan 5 mg CBZ-gln-gly, 0,1 ml NaOH 0,2 N, 0,02 ml NaOH 1,0 N, 0,2 ml Tris-HCl ph 6, 0,1 ml hydroxylamine dan 0,1 ml glutathione di dalam eppendorf, kemudian ditambahkan enzim sebanyak 0,2 ml. Untuk blanko ditambahkan miliq water sebanyak 0,5 ml. Kemudian sampel dan blanko diinkubasi pada temperatur 37 o C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan reagen B pada sampel dan blanko. Reagen B dibuat dari 3 N HCl, 12% TCA dan 5% FeCl 3.6H 2 O dengan perbandingan 1:1:1. Setelah itu, blanko ditambahkan enzim sebanyak 0,2 ml. Perubahan warna yang terjadi diamati serta dibandingkan antara sampel dan blanko. Sampel dan blanko disentrifugasi pada suhu 4 o C; 5800 g; 30 detik. Kemudian keduanya diukur dengan elisa reader pada panjang gelombang 530 nm. 3.3.3.2 Uji protein (Bollag dan Edelstain, 1991) Kadar protein enzim transglutaminase yang diperoleh ditentukan dengan metode Lowry (Bollag dan Edelstain, 1991) dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Sejumlah enzim transglutaminase, ditambahkan ke dalam campuran larutan lowry A, larutan lowry B dan larutan lowry C dengan perbandingan 20:1:1. Sementara itu, di tempat terpisah dibuat campuran kontrol yang terdiri dari miliq water dan campuran larutan lowry A, larutan lowry B serta larutan lowry C (perbandingan 20:1:1). Selanjutnya campuran larutan ini diinkubasikan pada suhu kamar selama 15 menit, untuk kemudian ditambahkan pereaksi folin yang telah diencerkan dengan miliq water dengan perbandingan
24 1:10. Campuran larutan ini kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 45 menit untuk kemudian dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. 3.4 Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian pendahuluan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan, yaitu konsentrasi limbah cair surimi pada media pertumbuhan bakteri dengan berbagai taraf konsentrasi (0%, 25%, 50%, 75%, 100%) (v/v) dengan dua kali ulangan. Model linear untuk rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut (Mattjik dan Sumertajaya 2002): Y ij = µ + τ i + ε ij i = faktor (i = 1,2,3,4,5) j = ulangan (j = 1,2) keterangan : Y ij = respon percobaan karena pengaruh faktor penambahan limbah cair surimi pada faktor ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum τ i = pengaruh faktor perlakuan (penambahan limbah cair surimi) pada taraf ke-i ε ij = pengaruh galat percobaan karena faktor penambahan limbah cair surimi pada taraf ke-i dan ulangan ke-j Data parametrik (hasil uji aktivitas enzim dan protein) dianalisis secara statistik dengan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika hasil analisis menunjukkan berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey. Adapun perhitungan untuk uji lanjut Tukey sebagai berikut: keterangan : KTG = nilai kuadrat tengah galat r = jumlah ulangan r p = ditentukan dari tabel Analisis data yang digunakan dalam penelitian utama ialah menggunakan analisis deskriptif. Karakterisasi enzim transglutaminase bertujuan untuk
25 mengetahui kondisi optimum dengan cara melihat aktivitas enzim tertinggi. Penentuan hasil karakterisasi dilakukan dengan menggunakan microsoft excel 2007. Diagram alir kegiatan berikut menunjukkan produksi dan karakterisasi enzim transglutaminase dalam media lokal (limbah cair surimi) (Gambar 6). Streptoverticillium ladakanum Penentuan kurva pertumbuhan bakteri dan waktu propagasi Pembuatan inokulum (stater) Penentuan konsentrasi optimum limbah cair surimi (0%, 25%, 50%, 75% dan 100%) (v/v) Media standar : - Ekstrak khamir 0,25% - Pepton 1,05% - MgSO 4. 7H 2 O 0,05% - KH 2 PO 4 0,2% - NaHPO 4 0,5% - Gliserol 5% - Sodium kasein 2% Produksi enzim dalam jumlah banyak pada konsentrasi dan waktu optimum Karakterisasi enzim transglutaminase Pengukuran berat molekul protein dengan metode SDS-PAGE Penentuan ph optimum: - 200 mm bufer asetat (ph 4 6) - 200 mm bufer Tris HCl (ph 6 8) - 200 mm bufer borat (ph 8 9) Penentuan suhu optimum : Enzim diinkubasi pada berbagai suhu (25, 37, 50, 60 dan 70 o C) selama dua jam Ketahanan terhadap panas : enzim dipanaskan pada suhu 37, 50 dan 60 o C dan diukur setiap 20 menit Pengaruh ion logam : Kation Na +, K +, Li +, Cu +, Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+ dan Fe 3+ Pengaruh inhibitor: 1mM dan 5 mm inhibitor (EDTA dan PMSF) Gambar 6. Diagram alir produksi dan karkaterisasi enzim transglutaminase (modifikasi dari Tellez Luis et al., 2004; Worato dan Yongsawatdigul, 2005; Singh dan Mehta, 1994; Lin et al., 2008; Suzuki et al., 2000; Edelstein dan Bollag, 1991)