DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM i PRASYARAT GELAR... ii LEMBAR PERSETUJUAN... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix RINGKASAN... x DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... xv DAFTAR GAMBAR xvi DAFTAR LAMPIRAN... xvii BAB I. PENDAHULUAN... 1 1.1. Latar Belakang... 1 1.2. Rumusan Masalah... 4 1.3. Tujuan Penelitian... 5 1.4. Manfaat Penelitian... 5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA... 6 2.1. Kandidiasis... 6 2.2. Candida albicans... 9 2.3. Probiotik... 11 2.4. Lactobacillus sp... 14 2.5. Lactobacillus sp sebagai Probiotik Vagina... 14 2.6. Mekanisme BAL Dalam Mengontrol Mikroba Merugikan... 17 2.6.1. Asam Laktat... 19 2.6.2. Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 )... 22 2.6.3. Bakteriosin...... 24 2.7. Resistensi BAL Terhadap Antibiotika... 25 2.8. Ketahanan BAL Terhadap ph Rendah... 26 2.9. Ketahanan BAL Terhadap Garam Empedu (Bile Salt)... 28 2.10.BAL Isolasi dari Makanan Terfermentasi... 30 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN... 32 3.1. Kerangka Berpikir... 32 3.2. Konsep Penelitian... 35 3.3. Hipotesis Penelitian... 36 xii
xiii BAB IV. METODE PENELITIAN... 37 4.1. Rancangan Penelitian... 37 4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian... 38 4.3. Ruang Lingkup Penelitian... 38 4.4. Penentuan Sumber Data... 38 4.5. Variabel Penelitian dan Difinisi Operasional... 39 4.5.1. Variabel Penelitian... 39 4.5.2. Definisi Operasional... 39 4.6. Bahan Penelitian... 40 4.7. Instrumen Penelitian... 41 4.8. Pemilihan Antifungi... 42 4.9. Prosedur Penelitian... 42 4.9.1. Pengambilan Sampel Makanan Terfermentasi... 44 4.9.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Asinan Sawi, Tape Ketan dan Kimchi... 44 4.9.2.1 Pewarnaan Gram... 45 4.9.2.2 Uji Katalase...... 45 4.9.2.3 Uji Produksi Gas dari Hasil Metabolisme Glukosa... 46 4.9.3. Uji Antagonisme Bakteri Asam Laktat Terhadap Candida albicans... 46 4.9.4. Uji Aktivitas Supernatan Bebas Sel (SBS) Sebelum dan Setelah Dinetralkan Isolat BAL terhadap Candida albicans...... 46 4.9.5. Uji Kompetisi BAL dengan Candida albicans... 47 4.9.5.1. Pembuatan Kontrol... 47 4.9.5.2. Uji Kompetisi... 48 4.9.6. Uji Ketahanan Bakteri Asam Laktat Isolat Makanan Terfermentasi Terhadap ph Rendah... 49 4.9.7. Uji Ketahanan Bakteri Asam Laktat Isolat Makanan Terfermentasi Terhadap Asam Deoksikolat... 50 4.9.8. Uji Biotransformasi Asam Kolat Menjadi Asam Deoksikolat oleh BAL Isolat Makanan Terfermentasi... 50 4.9.9. Uji Resistensi BAL Terhadap Antifungi... 52 4.9.10. Identifikasi Molekuler Bakteri Asam Laktat Isolat Asinan Sawi, Tape Ketan dan Kimchi... 52 4.9.10.1. Isolasi Genomik DNA... 52 4.9.10.2. Amplifikasi 16S rdna PCR... 53 4.9.10.3. Elektroforesis... 54 4.9.10.4. Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rdna... 55 4.9.11. Analisis Data... 55 xiii
xiv BAB V HASIL PENELITIAN... 56 5.1. Hasil Isolasi Bakteri Asam Laktat... 56 5.2. Uji Antagonisme Isolat BAL terhadap C. albicans (Dual Culture Assay)... 58 5.3. Uji Penghambatan Supernatan Isolat BAL Terhadap C. albicans... 60 5.4. Uji Kompetisi Antara BAL dengan C. albicans... 60 5.5. Uji Ketahanan Isolat BAL Terhadap ph Rendah... 61 5.6. Uji Ketahanan Isolat BAL Terhadap Konsentrasi Tinggi NaDC... 62 5.7. Uji Kemampuan BAL dalam Mentransformasi Asam Kolat menjadi Asam Deoksikolat... 63 5.8. Uji Resistensi Kandidat BAL Terhadap Obat Antifungi... 64 5.9. Identifikasi Molekuler Isolat BAL... 65 BAB VI PEMBAHASAN... 69 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN... 78 7.1 Simpulan... 78 7.2 Saran... 79 DAFTAR PUSTAKA... 80 LAMPIRAN... 94 xiv
xv DAFTAR TABEL Halaman 5.1 Karakteristik Isolat BAL... 56 5.2 Rata rata Zona Hambat BAL terhadap C. albicans... 59 5.3 Rata-rata Zona Hambat yang terjadi pada kultur C. albicans setelah dipaparkan dengan Supernatan bebas sel BAL yang ph-nya belum dan sudah dinetralkan..... 60 5.4 Persentase penurunan populasi BAL dan C. albicans setelah ditumbuhkan bersama dalam MRS Broth dan TSB selama 24 jam... 61 5.5 Ketahanan Isolat Uji terhadap ph Rendah... 62 5.6 Ketahanan Isolat Uji terhadap Garam Empedu... 63 5.7 Hasil Blast-N Sequence Kim 26... 66 5.8 Hasil Blast-N Sequence Kim 45... 66 5.9 Hasil Blast-N Sequence Tp 3... 67 5.10 Hasil Blast-N Sequence Tp 5... 67 xv
xvi DAFTAR GAMBAR Halaman 1.1. Morfologi Candida dengan Kalium Hidroksida... 10 2.1. Jalur Pembentukan Asam Laktat melalui (a) Heterofermentatif dan (b) Homofermentatif... 21 3.1. Skema Konsep Penelitian... 35 4.1. Skema Prosedur Penelitian... 43 5.1 Hasil Pewarnaan Gram Isolat-isolat Tp3 (A), Tp5 (B), Kim26 (C) dan Kim45 (D)... 58 5.2 Besaran Zona Yang Terbentuk Oleh Isolat Uji Terhadap Pertumbuhan C. albicans... 59 5.3 Kromatogram Hasil Uji Transformasi Asam Kolat Menjadi Asam Deoksikolat...... 64 5.4 Hasil Uji Ketahanan Isolat BAL Uji Terhadap Obat Antifungi... 65 5.5 Dendogram Pohon Filogenetik Isolat BAL Kim-26, Kim-45, Tp-3 dan Tp-5... 68 xvi
xvii DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Besaran Zona Hambat yang Dibentuk oleh Isolat Isolat Uji Terhadap Pertumbuhan C. albicans... 94 2. Grafik Uji Ketahanan BAL Isolat Uji Terhadap ph Rendah dan Sodium Deoksikolat... 95 3. Uji Kompetisi Antara Bakteri Asam Laktat dengan C. albicans... 96 4. Gambar Isolasi BAL dari Asinan Sawi (a), Kimchi (b), Tape Ketan (c), Kimchi Koleksi Lab. Biosains (d), Candida albicans (e) dan (f ) foto pengecatan Gram Candida albicans dengan pembesaran 1000x... 97 5. Alat alat yang Digunakan Dalam Penelitian... 98 6. Hasil Blast-N BAL Isolat Kim 26, Kim 45, Tp 3 dantp 5... 99 7. Alignment Statistic Isolat BAL Kim 26 dan Kim 45 dengan Isolat Internasional pada Gene Bank... 104 8. Pembuatan Media dan Sterilisasi Alat... 113 9. Pembuatan Larutan... 115 10. Hasil Sekuensing 16S rdna Isolat BAL... 117 xvii
xviii ABSTRAK PENGENDALIAN PERTUMBUHAN Candida albicans DENGAN MENGGUNAKAN BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI MAKANAN TERFERMENTASI Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi, menskrining dan mengidentifikasi bakteri asam laktat (BAL) yang bersifat antagonis terhadap Candida albicans. BAL diisolasi dari berbagai makanan terfermentasi, seperti asinan sawi, tape ketan dan kimchi. Isolat yang diperoleh diskrining aktivitas antagonisnya terhadap biakan C. albicans. Selanjutnya isolat hasil skrining diuji ketahanannya pada lingkungan ph rendah, sodium deoksikolat (NaDC) konsentrasi tinggi, dan kemampuannya dalam mengkonversi asam kolat menjadi asam deoksikolat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 4 dari 31 isolat BAL yang berhasil diisolasi pada penelitian ini menunjukkan aktivitas antagonis terhadap C. albicans. Keempat isolat ini menunjukkan sifat resisten terhadap lingkungan ph rendah (ph 2) dan NaDC konsentrasi tinggi (0,6 mm). Semua isolat tersebut tidak menunjukkan kemampuan mengkonversi asam kolat menjadi asam deoksikolat. Identifikasi genotifik yang berdasarkan pada analisis kemiripan sekuen sebagian 16S rdna, menunjukkan bahwa isolat Tp-3 dan Tp-5 termasuk dalam kelompok kekerabatan Pediococcus pentosaseus dengan kemiripan berturut-turut 97% dan 99%. Isolat Kim-26 dan Kim-45 berkerabat sangat dekat dengan Lactobacillus plantarum dengan kemiripan 99%. Keempat isolat menunjukkan sifat resisten terhadap flukonazol (antifungi yang umum digunakan dalam terapi kandidiasis), mengindikasikan bahwa keempat isolat tersebut berpotensi diterapkan secara sinergis dengan antifungi tersebut dalam terapi yang berhubungan dengan infeksi kandida. Kata kunci :C. albicans, Bakteri Asam Laktat, Tape Ketan, Kimchi, 16S rdna xviii
xix ABSTRACT THE USE OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM FERMETED FOODS TO CONTROL THE GROWTH OF Candida albicans The objectives of this study were to isolate, screen, and identify lactic acid bacteria (LABs) antagonistic against Candida albicans. LABs were isolated from various fermented foods, such as asinansawi, tape ketan, and kimchi. Antagonistic activity of retrieved isolates against C. albicans was screened on dual culture assays. Isolates of LABs that showed potential to inhibit the growth of C. albicans were further tested for survival at low ph conditions, high levels of sodium deoxycholic (NaDC), and ability to convert cholic acid into deoxicholic acid. The result of this study showed that 4 of 31 LAB isolates successfully isolated in this study showed antagonistic activity against C. albicans. These four isolates survived well in acidic condition (ph 2) and in high level of NaDC (0.6 mm). None of them showed ability to convert cholic acid to deoxycholic acid. In the genotype identification which was based on similarities of their 16S rdna nucleotide sequence, isolates of Tp-3 and Tp-5 were found to be closely related to Pediococcus pentosaseus with percentage similarities of 97% and 99%, respectively with those deposited in the Gene Bank data. Isolates Kim-26 and Kim-45 showed close relationship with Lactobacillus plantarum (with 99% similarity). These four isolates also showed resistance to fluconazole (an antifungi commonly used in the therapies of candidasis), indicating that they have potential to be sinergically applied with this antifungi in the therapies of candida-related infections. Keywords :C. albicans, lactic acid bacteria, Tape Ketan, Kimchi, 16S rdna xix
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Infeksi Candida merupakan kasus yang sangat sering ditemukan pada wanita dan menimbulkan masalah yang sangat serius pada kesehatan, terutama pada bagian genitalianya. Kasus ini mengalami peningkatan dari waktu ke waktu, terutama pada pasien-pasien yang termasuk dalam kelompok imunokompromais. Infeksi oleh Candida sering disebut dengan Kandidiasis. Istilah ini banyak digunakan di Amerika (Ramali, 2013). Di negara lain, seperti Kanada dan negara-negara Eropa, istilah kandidosis lebih sering digunakan (Ramali, 2013). Kandidiasis dapat bersifat lokal pada kulit, kuku, membran mukosa (mukosa mulut atau mukosa vagina), dan saluran cerna, atau bersifat sistemik pada endokardium, meningen sampai septicemia (Ramali dan Pitungui (2013) dan Sechell, 2014). Berdasarkan pada tingkat kekambuhannya yang tinggi, infeksi kandidiasis dapat dikatagorikan sebagai tingkat akut, subakut atau kronis ke episodik (Suyoso, 2011). Variasi penyakit kandidiasis dapat ditemukan di seluruh belahan dunia. Kandidiasis interdigitalis dan onikomikosis kandida, misalnya lebih sering ditemukan di daerah tropis yang beriklim dingin (Ramali, 2013). Kandidiasis vaginal dan vulvovaginal (KV) merupakan penyebab vaginitis tersering kedua pada wanita. Menurut Suyoso, (2013) sekitar tiga-perempat (75%) wanita dapat mengalami suatu episode KV dalam hidup mereka. Penyebab utama KV ini 1
2 adalah C. albicans dan C. glabrata (Suyoso, 2013). Dari kasus-kasus yang dilaporkan, sebanyak 80%-90% KV disebabkan oleh C. albicans (Suyoso, 2013). KV merupakan salah satu faktor resiko akibat penggunaan antibiotika dan steroid sistemik, diabetes melitus, adanya alat kontrasepsi dalam rahim, mengenakan pakaian ketat terutama yang terbuat dari bahan sintetis, serta imunosupresi. Halhal tersebut dapat mengganggu flora normal vagina, terutama kelompok bakteri Lactobacillus spp. yang berperan dalam menghambat pertumbuhan berlebih dari patogen Candida (Kundu and Garg, 2012). Sampai saat ini, terapi terhadap penderita kandidiasis umumnya masih mengandalkan antifungi yang bersifat topikal. Pada penderita KV, itrakonazol dan flukonazol dari golongan azol dan nystatin dari golongan polien paling banyak dipakai dalam terapi (Tjay dan Rahardja, 2007 ; Suyoso, 2013). Price and Wilson, (2002) melaporkan bahwa antifungi golongan azol memiliki efektifitas terapi hingga 90% pada pasien kandidiasis yang telah menyelesaikan terapi. Mekanisme kerja antifungi golongan ini dalam menghambat mikroba adalah dengan cara berikatan pada enzim cytochrome P-450 sterol C-14 alpha-demethylation, sehingga terjadi hambatan dalam sintesa ergosterol yang diperlukan oleh jamur dalam membentuk membran sel dan menyebabkan kerusakan pada membran tersebut (Tjay dan Rahardja, 2007). Sedangkan, antifungi golongan polien memiliki mekanisme pengikatan pada zat-zat sterol pada dinding sel jamur sehingga mengganggu permeabilitas membran. Terganggunya permeabilitas dan rusaknya struktur membran dapat berakibat fatal pada proses transport materi
3 melewati membran dan bahkan sering mengakibatkan kematian sel karena keluarnya komponen intraseluler dalam jumlah yang berlebih (Lewis, 2011). Pendekatan lain yang mulai banyak dikaji dalam dekade terakhir ini adalah pemanfaatan probiotik (Steve Taylor, 2004). Probiotik merupakan mikroba bermanfaat yang dapat memperbaiki keseimbangan mikrobial pada tubuh manusia (FAO/WHO, 2006). Probiotik dapat membantu mengurangi infeksi kandidiasis dengan cara menghambat pertumbuhan jamur penyebab penyakit ini yang aplikasinya dapat disinergikan dengan pemakaian antifungi. Walaupun belum ada bukti spesifik yang menunjukan bahwa probiotik lebih unggul atau lebih efektif daripada antifungi, penggunaan probiotik ini telah banyak direkomendasikan oleh beberapa peneliti, seperti Senok, et al. (2009), karena probiotik dapat menjaga keseimbangan flora normal dalam tubuh. Penggunaan probiotik sebelum, selama, dan sesudah pengobatan dengan antifungi ditujukan untuk mengurangi kekambuhan KV. Salah satu genus bakteri asam laktat yang banyak digunakan sebagai probiotik adalah Lactobacillus. Kelompok bakteri ini merupakan Bakteri Asam Laktat (BAL) yang pre dominan sebagai flora normal vagina (Masood, et al., 2009). Bakteri ini berperan dalam menghasilkan asam laktat yang bermanfaat dalam mempertahankan keasaman (ph) vagina, sehingga keseimbangan flora dalam vagina dapat terjaga. Untuk menjaga populasi BAL di dalam vagina, pemberian yogurt per oral sering dilakukan. Pemberian yogurt per oral setiap hari dilaporkan dapat membantu mengurangi insiden infeksi KV pada pasien yang sedang terapi (Price and Wilson, 2002).
4 Sebagai agen yang berperan dalam menurunkan ph vagina, Bakteri Asam Laktat (BAL) dari genus Lactobacillus juga menunjukan aktivitas antimikroba melalui produksi asam organik atau produksi senyawa lain seperti bakteriosin atau peptida anti jamur (Pieter, et al., 2005). Senyawa-senyawa tersebut dapat mencegah atau menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur yang bersifat patogen yang terdapat di dalam vagina (Ahmadova, et al., 2013). Berdasarkan pada latar belakang diatas, maka pada penelitian ini akan dilakukan skrining BAL yang dapat menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans penyebab kandidiasis. Selain itu, resistensi BAL terhadap beberapa jenis antifungi yang umum dipakai dalam terapi KV dan mekanisme penghambatan yang dilakukan oleh BAL terhadap jamur Candida albicans juga akan dipelajari. 1.2. Rumusan Masalah 1. Apakah Bakteri Asam Laktat dapat menghambat pertumbuhan Candida albicans penyebab kandidiasis dalam percobaan in vitro? 2. Apakah Bakteri Asam Laktat yang berhasil diisolasi bersifat resisten terhadap antifungi flukonazol yang umum dipakai dalam terapi kandidias sehingga dapat digunakan secara sinergis sebagai terapi pendukung? 3. Bagaimakah mekanisme Bakteri Asam Laktat dalam menghambat pertumbuhan Candida albicans penyebab kandidiasis? 4. Apakah nama spesies dari Bakteri Asam Laktat yang paling efektif untuk mendukung terapi kandidiasis?
5 1.2. Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui adanya aktivitas antifungi dari Bakteri Asam Laktat dalam menghambat pertumbuhan C. albicans penyebab kandidiasis. 2. Untuk mengetahui ketahanan Bakteri Asam Laktat terhadap flukonazol sebagai terapi kandidiasis sehingga dapat digunakan secara sinergis sebagai terapi pendukung. 3. Untuk mengetahui mekanisme Bakteri Asam Laktat dalam menghambat pertumbuhan C. albicans penyebab kandidiasis. 4. Untuk mengetahui nama spesies Bakteri Asam Laktat yang dapat digunakan sebagai terapi pendukung kandidiasis. 1.3. Manfaat Penelitian 1.3.1 Manfaat teoritis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi dalam pengembangan supporting treatment sebagai terapi non antifungi untuk kandidiasis. 1.3.2 Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi dalam pengembangan isolat Bakteri Asam Laktat sebagai mikroorganisme probiotik baru untuk menangani kandidiasis.