IV. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 4.1. Waktu dan Tempat Percobaan Percobaan pendahuluan dilaksanakan pada bulan November 2011-Februari 2012. Penelitian utama akan dilaksanakan pada bulan Mei 2012. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia Pangan, Keteknikan Pengolahan Pangan, Pilot Plant dan Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian serta di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. 4.2. Bahan dan Alat Percobaan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah akar kawao (Millettia sericea). Akar kawao yang digunakan adalah akar kawao dengan ukuran diameter akar sekitar 2-6 cm dengan ciri-ciri kulit bagian luar belum mengeras, berwarna kuning kecoklatan dan bagian dalam berair. Bahan untuk analisis adalah akudes, NaCl fisch, media Nutrien Agar (NA), media Potato Dextrose Agar (PDA), sukrosa, H 2 SO 4 1%, BaCl 2 1%, kertas cakram, kain saring, kultur murni S.cerevisieae, L.mesenteroides dan E. coli. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven blower, autoclave, hummer mill, retsch mill, inkubator, kompor gas, ayakan tyler, timbangan analitik, spektrofotometer, botol gelap, gelas ukur, erlenmeyer, rak tabung, bunsen, beaker glass, tabung reaksi, cawan petri, corong, termometer, aluminium foil, volume pipet, pipet tetes, plastik bersiler, kain saring, spatula, pinset, kertas saring Whatman No.1 dan kain saring. 29 FTIP001657/001
30 4.3. Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode percobaan ( Experimental Method) menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) pola faktorial yang terdiri dari dua faktor dengan 3 ulangan. Faktor pertama adalah Suhu Maserasi (A) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu: a 1 = 25 o C a 2 = 30 o C a 3 = 35 o C Faktor kedua adalah Lama Maserasi (B) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu: b 1 = 18 jam b 2 = 24 jam b 3 = 30 jam Berdasarkan kedua faktor tersebut diperoleh 9 kombinasi perlakuan yang disajikan secara lengkap pada Tabel 2. Tabel 2. Kombinasi Perlakuan Faktor A b 1 Faktor B b 2 b 3 a 1 a 2 a 3 Tabel 3. Tata Letak Percobaan Ulangan I Ulangan II Ulangan III FTIP001657/002
31 Model linier Rancangan Percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut Y ijk = µ + A i + B j + R k + (AB) ij + ε ijk Keterangan : Y ijk = Respon yang diamati faktor A taraf ke-i dan faktor B taraf ke-j pada ulangan ke-k. µ = Rata-rata umum A i B j R k (AB) ij ε ijk = Pengaruh faktor A taraf ke-i = Pengaruh faktor B taraf ke-j = Pengaruh ulangan taraf ke-k = Pengaruh interaksi faktor A taraf ke-i dan faktor B taraf ke-j = Galat Perlakuan. Berdasarkan model linier di atas dapat disusun analisis sidik ragam sebagai berikut : Tabel 4. Tabel Sidik Ragam Sumber keragaman DB JK KT F hit F 0,5 ( Y Ulangan 2.. ) (Y ) JKU KTU 3,63 9 27 1 KTG ( Y Perlakuan (P) 8. ) (Y ) JKP KTP 2,59 3 27 8 KTG Y Suhu Maserasi (A) 2.. Y JKA KTA 3,63 9 27 2 KTG ( Y Lama Maserasi (B) 2.. ) (Y ) JKB KTB 3,63 9 27 2 KTG JKAB KTAB Interaksi 4 JKP-JKA-JKB 3,01 4 KTG JKG Galat (G) 16 JKT-JKU-JKP 16 Total (T) 26 Y (Y ) JKT 27 26 Sumber : Gasperz (1991) Untuk mengetahui ada tidaknya keragaman pada setiap perlakuan digunakan uji F pada taraf 5 %. Jika Fh (F hitung) F 0.5 maka dinyatakan tidak ada keragaman di antara perlakuan, sedangkan jika Fh > F 0.5, maka dinyatakan ada keragaman antar perlakuan. FTIP001657/003
32 Uji lanjutan untuk menguji rata-rata perlakuan, dilakukan Uji Jarak Berganda Duncan pada taraf 5%, dengan langkah sebagai berikut: a. Nilai tengah perlakuan disusun dalam urutan meningkat. b. Hitung galat baku dari nilai tengah perlakuan, dan wilayah nyata terpendek untuk taraf nyata 5% - Untuk interaksi (AB): = = 5% - Untuk faktor (A): = = 5% - Untuk faktor (B): = = 5% dengan : r = banyaknya ulangan (3 kali) a = banyaknya taraf perlakuan A (3 taraf) b = banyaknya taraf perlakuan B (3 taraf) c. Mengurangkan nilai tengah perlakuan yang terbesar dengan wilayah nyata terpendek terbesar. Nyatakan semua perlakuan yang lebih kecil dari hasil pengurangan sebagai berbeda nyata dengan nilai tengah perlakuan terbesar. d. Membandingkan perbedaan selisih nilai tengah perlakuan yang belum dinyatakan berbeda nyata dengan nilai LSR yang sesuai. Jika selisih nilai tengah perlakuan lebih besar dari nilai LSR yang sesuai maka dinyatakan berbeda nyata dan sebaliknya. Jika kedua nilai tengah perlakuan yang dibandingkan tidak berbeda FTIP001657/004
33 nyata maka diberi tanda dengan dibubuhi garis. e. Ulangi langkah ketiga dan keempat untuk nilai tengah perlakuan terbesar kedua, ketiga, dan seterusnya sampai semua nilai tengah perlakuan dibandingkan. f. Berikan notasi huruf yang sama pada nilai tengah yang berada pada satu garis. Notasi huruf yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata. 4.4. Pelaksanaan Percobaan 4.4.1. Percobaan Pendahuluan Percobaan pendahuluan terdiri dari 4 tahapan yaitu : a. Karakterisasi senyawa fitokimia akar kawao dengan screening fitokimia kualitatif pada berbagai ukuran. b. Pembuatan dan karakterisasi serbuk akar kawao. c. Penentuan kisaran suhu ekstraksi akar kawao dengan pengamatan areal hambat pada biakan S.cerevisiae. d. Penentuan kisaran lama ekstraksi akar kawao dengan pengamatan areal hambat pada biakan S.cerevisiae. 4.4.2. Percobaan Utama Ekstraksi akar kawao dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : 1. Penimbangan Serbuk akar kawao dengan ukuran partikel sebesar 80 mesh ditimbang sebanyak 10 gram lalu dimasukkan ke dalam botol gelap. 2. Penambahan pelarut Penambahan pelarut dilakukan dengan menambahkan 50 ml akuades sehingga FTIP001657/005
34 menghasilkan larutan dengan konsentrasi 20% (b/v). 3. Proses maserasi Proses maserasi dilakukan dengan kombinasi suhu dan lama ekstraksi yaitu pada suhu 25ºC, 30ºC dan 35ºC serta pada lama 18 jam, 24 jam dan 30 jam. 4. Penyaringan Ekstrak akar kawao dipisahkan dengan residunya dengan menggunakan kertas saring. Ekstrak yang telah dihasilkan dimasukkan ke dalam botol gelap. Serbuk akar kawao 10 gram Akuades 50 ml Penambahan pelarut Proses Maserasi pada T = 25ºC, 30ºC dan 35ºC t= 18jam, 24jam dan 30 jam Penyaringan Ampas Ekstrak akar kawao Kawao Gambar 6. Diagram Proses Pembuatan Ekstrak akar Kawao (Modifikasi Dirga, 2011) 4.5. Kriteria Pengamatan Uji penghambatan S. cerevisieae, L. mesenteroides dan E. coli menggunakan metode difusi paper disk (Capuccino dan Sherman, 2001). FTIP001657/006