Pengujian enzim dan Aktivitasnya Pemeriksaan / uji Enzim : Kualitatif : ada / tidak Enzim / Substrat di sample Kuantitatif : 1. aktivitas enzim / konstata kinetik 2. Kadar substrat (enzim sbg reagent) Dasar Konstanta kinetik meliputi: 1. Turnover number ( Kcat) 2. Kecepatan Maksimal ( V max) 3. Ketetapan Michaelis ( Km)
Kondisi yg diperlukan pengujian enzim quantitqtif [S]. Vmaks Vi = ------------------ Km + [S] Vi = kecepatan initial V maks = kecepatan maksimal [S] = konsentrasi substrat pd Vi diukur Km = konstanta Michaelis
Kondisi yg diperlukan pengujian enzim quantitqtif Formula bisa dilihat di kinetika mikrobia Pengukuran Aktivitas Enzim : 1. Pada region A 2. Perubahan S tdk merubah Vi kinetika orde 0: [So] >> Km Km + [S] = [S] [S]. V maks Vi = ------- = Vmaks [S]
Kondisi yg diperlukan pengujian enzim quantitqtif Formula bisa dilihat di kinetika mikrobia Pengukuran konsentrasi substrat dg Enzim sbg reagent: 1. Pada region B 2. Perubahan S merubah Vi kinetika orde 1: [So] << Km Km + [S] = km [S]. V maks Vi = ------- Km = k [S]
1. Turnover number (Kcat) jumlah maksimum substrat yang di ubah ke produk setiap per detik dari suatu daerah aktif enzim. Turnover number = mol yang dikatalisis S x mol enzim 2. Kecepatan Maksimal (Vmax) percepatan maksimal yang dicapai oleh suatu reaksi enzim ketika konsentrasi substrate sedang terpenuhi.
3. Ketetapan Michaelis ( Km) konsentrasi substrate di mana tingkat reaksi enzim separuh dari Vmax. Ini merupakan suatu karakteristik konstant yang diberikan enzim.
SOAL 35 Sebanyak 10ml larutan β-galaktosidase murni (1,0 mg protein/ml), terhidrolisis menjadi 0,10 mmol o- nitrophenyl galactosidase (ONPG) selama 5 menit. Hitunglah : a. Aktivitas b. Aktivitas spesifik c. Turnover number of β-galaktosidase (asumsikan 1 mol wt untuk enzim adl 116 kd dan satu bagian aktif per molekul)
a. Mengubah sejumlah β-galaktosidase menjadi µmol dan waktu (t) mjd menit β-gal = 0,10 mmol x 1000 (µmol/mmol) = 100 µmol t = 5,0 min Menggunakan persamaan 101 = 20 µmol/ min = 20 IU dimana 1 IU = 1 µmol/ min
b. Total protein dalam pengujian = 1,0 mg/ml x 0,10 ml = 0,10 mg persamaan 102 = 200 µmol minˉ¹ mg ˉ¹ protein = 2,0 x 10² IU/ mg protein
c. Menggunakan persamaan 1
SOAL 36 sebotol kecil hexokinase lyophilized (total protein 100 mg; sp act 200 IU/mg dari protein) dilarutkan dalam 10 ml cairan. a. Hitunglah units/ml hexokinase dalam larutan b. Apakah volume larutan ini akan menghasilakn 50 IU hexokinase per ml dalam media assay c. Ulangi perhitungan untuk sebuah botol yang berisi 20.000 IU aktivitas total dan dilarutkan dengan 5 ml pengencer
Penyelesaian a. Units/mL = total aktivitas total volume = 200 IU/mg protein x 100 mg protein 10 ml = 2,000 IU/mL
b. Biarkan V1 menjadi volume larutan heksokinase dibutuhkan untuk menyiapkan larutan 1 ml (V2); C1 dan C2 adalah konsentrasi heksokinase dalam stok dan larutan akhir, masing-masing. Dengan menggunakan persamaan 39 V1 = C2V2 = 50 µmol min-1 ml-1 x 1 Ml C1 2.000 µmol min-1 ml-1 = 0,02 ml atau 20 µl Duapuluh µl larutan heksokinase ditambahkan ke 0,980 ml media assay untuk menghasilkan 50 IU/mL
c. Menghitung hexokinase aktivitas/ml larutan Units/mL = aktivitas total volume total = 20.000 IU 5,0 ml = 4.000 IU/mL
Berikut contoh dalam (b) V1 = C2V2 C1 = 50 IU/mL x 1 ml 4.000 IU/mL = 0,01 ml atau 10 µl Dimana C dan V didefinisikan sebagai (b), diatas Oleh karena itu, 10 µl larutan heksokinase ditambahkan ke 0,990 ml media assay untuk menghasilkan 50 IU/mL
Soal 37 Alcohol dehidrogenase dalam ekstrak sel diuji dengan menambahkan 0.10 ml ekstrak murni atau diencerkan sampai dengan 1.90 ml media uji yang mengandung ethanol (ETOH) dan NAD + dalam cuvette 1 cm. Absorbansi yang digunakan 340 nm ditera selama 10 menit diperoleh tabel 4.1.
Tabel 4.1 OD Time (min) DF 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 1 0 0.75 0.97 1.04 1.06 1.09 1 2 0 0.40 0.70 0.90 0.97 1.04 3 3 0 0.12 0.24 0.36 0.48 0.60 10 4 0 0.06 0.12 0.18 0.24 0.30 20
Pertanyaan a. Data mana yang digunakan untuk menghitung aktifitas alkohol dehydrogenase dan mengapa? b. Hitunglah aktifitas total dari alkohol dehydrogenase dalam 20.0 ml dari ekstrak.
Solusi a. Untuk menentukan data mana yang harus digunakan untuk menghitung aktivitas, dapat dilihat dari gambar 4.4 grafik konsentrasi produk [P] dengan waktu (t) dan gambar 4.5 grafik antara kecepatan (v) dengan waktu (t)
Grafik konsentrasi produk [P] dengan waktu (t)
Grafik perbandingan antara kecepatan (v) dengan waktu (t)
Dari kedua grafik di atas Data set 1 dan data set 2, tidak dapat digunakan untuk perhitungan aktifitas dikarenakan [P] dengan t (pd grafik 4.4) tidak linier dan v dengan t (pd grafik 4.5) tidak konstan Zero-order kinetic wajib untuk pengukuran aktifitas, dimana v harus konstan dan [P] harus mengalami kenaikan secara linier terhadap waktu. Kondisi ini dipenuhi oleh data set 3 dan 4 (grafik 4.4 dan 4.5) karena keduanya dapat digunakan untuk perhitungan aktifitas. Akan tetapi, reaksi pada data set 4 berjalan agak lambat. Sehingga data set 3 adalah data yang paling tepat untuk digunakan dalam perhitungan aktivitas.
b). Jarak waktu antara 0 dan 8 min t= (8,0-0,0) min = 8,0 min OD = (0,48-0) = 0,48 Menggunakan Persamaan 84, menghitung jumlah NADH yang terbentuk : [NADH] = A/El = 0,48/6220 M -1 cm -1 x 1 cm = 7,72 x 10-5 M
Mol NADH dibentuk pada 2 ml medium = 7,72 x 10-5 (mol/l) x 2,0 ml/1000(ml/l = 1,54 x 10-7 mol = 0,154 µmol Menghitung aktivitas/ml ekstrak menggunakan persamaan 97 dan faktor pengenceran 10, hanya 0,10 ml dari 20,0 ml ekstrak diuji. activitas/ml = 0,154 µmol/10,0 min x 1/0,10 ml = 1,54 µmol min -1 ml -1 Total aktivitas = aktivitas/ml x total volume = 1,54 µmol min -1 ml -1 x 20,0 ml = 31 µmol/min = 31 IU