PRAKTIKUM UJI KANDUNGAN PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

Transkripsi

1 PRAKTIKUM UJI KANDUNGAN PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD Disusun Oleh : ARGHYA NARENDRA DIANASTYA ( ) (Mahasiswa Penerima Beasiswa Unggulan S-1 PS. Agroteknologi Fakultas Pertanian UNEJ) PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JEMBER 2012

2 1. PENDAHULUAN Semua sistem kehidupan mengandung sejumlah besar protein yang berbeda. Perbedaannya terdapat pada asam amino, urutan asam amino, kandungan nonasam amino, bobot molekul, dan faktor yang menentukan konformasi protein. Dalam hal tersebut, untuk menentukan struktur protein tertentu kita diharuskan untuk protein tersebut dari bahan non protein dan dari protein yang lain (Robinson, 1995). Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus aminop dan gugus karboksil yang dimiliki. Jika protein tersebut memiliki bobot senyawa yang kurang dari 6.000, biasanya digolongakn kedalam polipeptida. Secara umum, pada hidrolisis protein tertentu biasanya ditemukan 16 sampai 20 asam amino yang berlainan. Asam amino dalam sebuah protein tersusun secara saling berkaitan membentuk rantai polimer lurus dengan sambung silang antara gugus sulfhidril sisteina membentuk jembatan disulfida (Robinson, 1995). Protein memiliki beberapa fungsi, lima diantaranya adalah sebagai: biokatalisator, protein cadangan, biomol pentrasfer bahan, struktural, dan protektif.namun demikian, pada umumnya protein dikenal sebagai bagian dari makanan yang dipergunakan sebagai pengganti jaringan sel (Martoharsono, 1998). Protein memiliki keragaman dan kerumitan. Adanya keragaman dan kerumitan tersebut mendorong terciptanya bagan penggolongan. Protein tumbuhan sebagai contoh telah dikelompokkan berdasarkan sumbernya. Secara umum didalam tumbuhan terdapat dua portein, yaitu portein biji dan protein daun. Protein tersebut lebih lanjut dibagi menjadi protein embrio dan protein endosperma pada protein biji dan protein kloroplas unttuk protein daun (Robinson, 1995). Bagan penggolongan lain didasarkan kepada penglompokan menjadi protein sederhana, yaitu protein yang pada hidrolisisnya hanya menghasilkan asam amino alfa, dan protein konjugasi. Protein konjugasi adalah protein yang pada proses

3 hidrolisisnya menghasilkan asam amino dan senyawa lain. Anak golongan utama protein sederhana dicantumkan dalam Penggolongan Osborne. Beberapa contoh protein tersebut adalah Albumin, Globulin, Glutelin, Prolamin Histon (Robinson, 1995). Terdapat beberapa golongan protein sederhana yang tidak dapat dimasukkan ke dalam salah satu golongan pada bagan klasik ini. Satu kelompok protein penting ialah protein yang bersifat asam yang berkaitan dengan DNA kromosom atau RNA ribosom (Robinson, 1995). Pada tanaman, konsentrasi protein tertinggi didapati dalam biji sebesar 40% dan ditemukan dalam biji dari berat keringnya. Protein dalam biji akan digunakan sebagai energi dalam perkecambahan biji. Protein dalam tanaman larut dalam air, namun demikian terdapat protein yang terikat pada membran lipoprotein sehingga yang akan dihitung adalah total protein terlarut. Hal tersebut dikarenakan sebagai pelarut atau buffernya merupakan air (Siswoyo dan Handoyo, 2012). Terdapat beberapa cara untuk menentukan konsentrasi protein, salah satunya menggunakan pengujian bradford. Pengujuian Bradford merupakan metode yang sering digunakan, khususnya dalam penentuan kandungan protein dari fraksi sel atau dari gel electrophoresis. Metode ini merupakan prosedur standar dengan sensivitas antara ug protein. Lebih lanjut, pengujian ini ddidasarkan pada observasi bahwa absorban maksimum untuk larutan asam dari CBB G-250 antara 165 nm sampai 595 nm ketika protein terikat (Siswoyo dan Handoyo, 2012). Untuk mengetahui langkah pengukuran kandungan protein dengan meode Branford, dilaksanakan praktikum yang mengukur kandungan protein dalam biji dan daun tanaman kakao.

4 1. TUJUAN 1. Untuk mengetahui cara pengukuran kandungan protein dengan meode Bradford menggunakan bahan biji dan daun tamaman kopi dan kakao; 2. Untuk mengetahui seberapa besar kandungan protein pada biji dan daun tanaman kopi dan kakao; 3. Untuk membandingkan kadar protein antara biji dan daun kopi serta kakao. 3. BAHAN DAN METODE 3.1 Alat dan Bahan Alat : 1. Tabung Reaksi 2. Mikropipet (20, 200 dan 1000 ul) 3. Inkubator 4. Spekrofotometer 5. Rak tabung reaksi

5 3.1.2 Bahan : 1. Coomassie Brilliant Blue G % Ethanol 3. 85% Phosphoric Acid 4. BSA (Bovine Serum Albumine) sebagai standar 5. Bradford reagent : 100 mg Coomasie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95% dan ditambahkan 100 ml (w/v) Phosphoric acid dan tambahkan aquades sampai volume 1 liter. Saring larutan dengan kertas whatman sebelum digunakan. 3.2 Cara kerja : 1. 2 gr sampel digerus dengan mortar pestle setelah diberi nitrogen cair. 2. Tambahkan 3 kali volume buffer ekstraksi yang mengandung (100 mm MOPS- NaOH (ph 7,5), 10 mm MgCl 2, 1 mm EDTA, 10 mm beta-2 mercaptoenol dan 10 % PVP. 3. Homogenat dimasukkan dalam 4 ependorf dan disentrifugasi pada kecepatan rpm 4 o C selama 10 menit, kemudian ambil supernatan dan digunakan sebagai sumber enzim (satu epedorf untuk pengukuran protein ). Pembuatan grafik standar BSA 1. Siapkan 5 tabung mikro sentrifuse (beri nomor 1-5), kemudian isi masing masing dengan bahan seperti table dibawah ini : Nomor Volume BSA Larutan Buffer Bradford Reagent (ul) Tabung (ul) (ul)

6 Catatan : - Konsentrasi larutan stok BSA = 1 UG UL-1 Setelah didiamkan selama 15 menit ukur OD 595 nm dengan spektrofotometer. Cari persamaan regresinya sebagai X adalah OD 596 dan sebagai Y adalah jumlah BSA. Pengukuran sampel 1. Masukkan sampel protein sebanyak 25 ul ke dalam tabung mikrosentrifugasi dilakukan 4 kali pengenceran dan ditambah larutan buffer sebanyak 30 ul dan divortex. 2. Tambahkan 950 ul reagent Bradford dan divortex menit kemudian ukur OD pada panjang gelombang 595 nm 4. Hitung kandungan protein sampel menggunakan grafik standar BSA

7 4. HASIL PERCOBAAN 4.1 Pembuatan Kurva Standar Analisis Protein Metode Bradford Kurva Standar Absorban Konsentrasi BSA (mg/ml) 0,000 0,000 0,427 5,000 0,516 10,000 0,655 20,000 0,665 25, Pengukuran Absorban Sampel Kopi-Kakao Sampel A595 Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Biji Kopi 0,601 0,610 0,587 Daun Kopi 0,583 0,571 0,595 Biji Kakao 0,401 0,434 0,431 Daun Kakao 0,409 0,438 0, Penentuan Persamaan Regresi Persamaan Regresinya adalah y = 33,36x - 3, Penentuan Persamaan Regresi Kadar Protein (mg/ml) Kandungan Protein Sampel Ulangan ke- 1 Ulangan ke- 2 Ulangan ke- 3 Rata-rata Stdev Sampel dan Toleransi Kesalahannya

8 Biji Kopi 3,389 3,450 3,296 3,378 0,077 3,378 ± 0,077 Daun Kopi 3,269 3,189 3,349 3,269 0,080 3,269 ± 0,080 Biji Kakao 2,055 2,275 2,255 2,195 0,122 2,193 ± 0,099 Daun Kakao 2,108 2,302 2,168 2,193 0,099 2,195 ± 0,123

9 5. PEMBAHASAN Metode Bradford adalah salah satu metode yang digunakan untuk mengukur kandungan protein. Metode tersebut dilakukan pertama kali oleh Bradford (Bradford et al., 1976). Pada saat ini, metode Bradford telah banyak dilakukan untuk mengukur kandungan protein karena metode tersebut dinilai mudah, cepat, dan hasilnya cukup akurat. Selain itu, pengukuran kandungan protei dengan metode Bradford lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein yang sering kali mengganggu jalannya pengujian kuantitatif protein. Pengujian kandungan protein dengan metode Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Briliant Blue G-250 terhadap protein. Coomassie Briliant Blue G-250 memiliki formasi ion berbeda dengan nilai pka 1.15, 1.82 dan Bentuk kationik zat warna tersebut berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi (panjang gelombang serapan) maksimum 590 nm. Namun, untuk pengukuran protein dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru) serta dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm. Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda. Protein dengan residu arginil dan lysil lebih banyak, akan menghasilkan warna biru yang lebih intens. Sedangkan, protein yang memiliki residu arginil dan lysil lebih sedikit, warna biru tidak lebih intens, walaupun jumlah proteinnya sama. Metode Bradford merupakan metode yang paling sesuai dan umum digunakan. Metode Bradford memiliki dua jenis assay protein, yaitu Standar Assay dan Microassay. Standar Assay digunakan untuk pengukuran kadar protein antara 10 sampai 100 µg, sedangkan Microassay digunakan untuk pengukuran kadar protein antara 1 sampai 10 µg. Namun, pengukuran dengan Microassay umumnya lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein. Prinsip kerja analisis protein dengan metode Bradford adalah spektrofometri. Spektrofotometri adalah sebuah alat yang dapat memberikan nilai absorban pada sampel. Spektrofotometri akan mengirimkan cahaya berupa cahaya

10 tampak yang akan diserap oleh sampel. Semakin besar cahaya yang diserap, maka semakin besar nilai absorbannya. Namun, kandungan protein tidak dapat langsung diketahui. Kandungan protein setiap sampel harus dihitung lagi menggunakan nilai absorban setiap sampel. Secara umum, protein terdapat pada hampir setiap susunan sel mahluk hidup. Pada tanaman yang menghasilkan biji, kandungan protein lebih dominan terdapat pada bagian biji. Sebagai contoh pada tanaman kopi dan kakao. Hasil percobaan yang kami lakukan dengan membandingkan kandungan protein pada biji dan daun menunjukkan bahwa kandungan protein pada biji lebih banyak dibandingkan pada bagian daun. Hasil rata-rata perhitungan kandungan protein pada biji kopi 3,378 sedangkan pada daun kopi 3,269, sehingga kita dapat mengetahui bahwa kandungan protein pada biji jauh lebih tinggi 0,109 dibandingkan pada bagian daun kopi. Sedangkan, hasil perhitungan rata-rata kandungan protein dalam biji kakao sebesar 2,881 dan pada daun kakao 2,193. Selisih yang didapatkan dari perbedaan kandungan protein biji kakao dan daun kakao adalah 0,688. Dari hasil analisa protein yang dilakukan, dapat diketahui pula bahwa kandungan protein pada biji dan daun kopi lebih besar terhadap biji dan daun kakao. Hal tersebut dikarenakan pada tanaman kopi, sebagian hasil fotosintat diubah menjadi protein, sedangkan pada tanaman kakao, hasil fotosintat secara umum diubah menjadi bentuk lemak. Namun demikian, kandungan dari hasil fotosintat yang tersimpan masih tergantung pada usia tanaman. Seperti hasil penelitian Wealth of India (1990), kandungan protein dari 100 gram biji kopi adalah sebesar 11,23 gram. Menurut Belitz et al., kandungan protein biji kakao adalah 11,5. Perbedaan kandungan protein dengan metode Bradford pada penelitian kami tidak sesuai dengan pernyatan tersebut, karena terdapat faktorfaktor kesalahan terjadi ketika penelitian. Sehingga, hal itu memengaruhi hasil dari kandungan protein. Didalam praktikum terdapat faktor-faktor kesalahan yang mempengaruhi hasil pengukuran kandungan protein, hal tersebut diantaranya meliputi penggerusan biji dan daun pada kopi dan kakao. Penggerusan akan mempengaruhi

11 halus tidaknya bahan yang digerus. Semakin halus, maka analisis protein yang dilakukan akan semakin mudah. Hal tersebut dikarenakan, semakin halus substrat yang ditumbuk, maka akan memudahkan dalam hal reaksi terhadap Bradford reagen. Selain itu, faktor keseterilan alat sangat berpengaruh. Semakin steril alat praktikum yang digunakan, maka semakin baik hasil yang diperoleh. Faktor manusia, juga mmempengaruhi dalam analisa protein. Hal tersebut dikarenakan sering terjadinya human eror dalam pencatatan hasil dan pengelolahan data. Kandungan protein semua bahan, protein2 itu berada dimana? Perbandingan protein pada biji dan daun kopi dan kakao, kenapa kok beda Perbandingan protein pada kopi dan kakao, kenapa kok beda 6. KESIMPULAN DAN REKOMENDASI

12 6.1 Kesimpulan Uji kandungan protein dengan metode Bradford sangat mudah dan cukup akurat. Kandungan protein pada tanaman yang menghasilkan biji umumnya banyak terdapat pada bijinya dibandingkan pada daunnya, seperti pada kakao dan kopi. Hal itu karena hasil fotosintat lebih banyak disimpan pada biji kakao maupun kopi. 6.2 Rekomendasi Sebaiknya dalam melaksanakan praktikum penentuan kandungan protein dengan metode Bradford harus benar-benar teliti. Tingkat ketelitian akan memengaruhi keakuratan hasil. Selain itu, alat-alat yang digunakan harus steril serta sampel yang digerus benar-benar halus agar hasilnya juga akurat. DAFTAR PUSTAKA

13 Bradford, MM A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: Martoharsono, S Biokimia Jilid I. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Robinson, T Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: Penerbit ITB. Siswoyo, T.A. dan Handoyo, T Petunjuk Praktikum Biokimia Tanaman (Tidak Diterbitkan). Jember: Universitas Negeri Jember