BM-506 KETERAMPILAN DASAR LABORATORIUM LAPORAN PRAKTIKUM 04 Metaolime & Spektrofotometri Donny Nauphar & M.Anwar TUJUAN Mahaiwa memahami cara penggunaan pektrofotometri dan prinip daar-daar tehnik dari pektrofotometri dan memuktikan keenaran Hukum Beer-Lamert Melakukan pengenceran dengan decimal delution dan douling delution Melakukan pemuatan larutan tok glukoa Melakukan pemuatan grafik dan interpretainya dari data yang diperoleh Melakukan pemerikaan kadar glukoa darah, urea, dan triglerida dengan metode pektrofotometri ALAT DAN BAHAN Pipet Mohr, pipet otomatik 10-100µl, entrifu, waterath uhu 37 C, kit pemerikaan glukoa, kit pemerikaan urea, kit pemerikaan triglierida, glukoa, taung reaki dan rak, cuvette CARA KERJA Pengenceran Glukoa dengan Douling Dilution (Faktor 1, 2,4,8,16,32,64,128) Glukoa Glukoa Glukoa Glukoa Glukoa Glukoa 2ml Glukoa Faktor 1 Faktor 2 Faktor 4 Faktor 8 Faktor 16 Faktor 32 Faktor 64 Faktor 128
Pengenceran Glukoa dengan Decimal Dilution (Faktor 1, 3, 30, 300) 0.6ml Glukoa 0.2ml Glukoa 0.2ml Glukoa 2ml Glukoa Faktor 1 1.4ml Faktor 3 1.80ml Faktor 30 1.80ml Faktor 300 Pengeceran Glukoa dengan Decimal Dilution (Faktor 1, 10, 100) 0.2ml Glukoa 0.2ml Glukoa 2ml Glukoa Faktor 1 1.8ml Faktor 10 1.8ml Faktor 100 Untuk pemerikaan glukoa, triglierida dan urea Amil darah vena maukkan dalam wadah yang telah erii EDTA, entrifue ± 15 menit Amil 23 taung reaki: Taung reaki 1 : reagenia glukoa (lank) Taung reaki 2 : reagenia glukoa + 10µl glukoa tandart (tandart) Taung reaki 3 : reagenia glukoa + 10µl plama (ampel) Taung reaki 4 : reagenia triglierida (lank) Taung reaki 5 : reagenia triglierida + 10µl triglierida tandart (tandart) Taung reaki 6 : reagenia triglierida + 10µl plama (ampel) Taung reaki 7 : reagenia urea (lank) Taung reaki 8 : reagenia urea + 10µl urea tandart (tandart) Taung reaki 9 : reagenia urea + 10µl plama (ampel)
Taung reaki 10 : reagenia glukoa + 10µl faktor 1 Taung reaki 11 : reagenia glukoa + 10µl faktor 2 Taung reaki 12 : reagenia glukoa + 10µl faktor 4 Taung reaki 13 : reagenia glukoa + 10µl faktor 8 Douling dilution Taung reaki 14 : reagenia glukoa + 10µl faktor 16 Taung reaki 15 : reagenia glukoa + 10µl faktor 32 Taung reaki 16 : reagenia glukoa + 10µl faktor 64 Taung reaki 17 : reagenia glukoa + 10µl faktor 128 Taung reaki 18 : reagenia glukoa + 10µl faktor 1 Taung reaki 19 : reagenia glukoa + 10µl faktor 3 Taung reaki 20 : reagenia glukoa + 10µl faktor 10 Decimal dilution Taung reaki 21 : reagenia glukoa + 10µl faktor 30 Taung reaki 22 : reagenia glukoa + 10µl faktor 100 Taung reaki 23 : reagenia glukoa + 10µl faktor 300 Maukkan taung reaki 1,2,3 kedalam waterath (uhu 37 C) ± 10 menit, taung reaki 4,5,6 kedalam waterath (uhu 37 C) ± 5 menit, taung reaki 7,8,9 diamkan dalam uhu ruangan (25 C) ± 5 menit. Kemudian maukkan maing-maing taung reaki ke dalam cuvette, hidupkan alat pektrofotometri dan atur panjang gelomang (glukoa: 500nm, triglierida 530nm, urea 600nm), et aorance pada angka 0 Maukkan cuvette yang erii larutan lank ke ample holder pada pektrofotometri, et tranmii %T pada 100 Maukkan cuvette larutan tandart : catat hail A: Aorance tandart Maukkan cuvette larutan ample : catat hail Au : Aorance zat yang diukur Begitu juga untuk pemerikaan douling dilution & decimal dilution eelumnya maukkan lank dan tandart glukoa. Kemudian hail maukkan dalam Hukum Beer-Lamert Au = Cu, Cu = Au C A C A Dimana : Au = Aorance zat yang di ukur A = Aorance tandart Cu = konentrai zat yang akan diukur C = konentrai larutan tandart (glukoa 100mg/dl, triglierida 200mg/dl, urea 40mg/dl) HASIL Faktor Konentrai Grup Meja 3 Grup Meja 5 1 500 3.972 2.019 2 250 4 3.602 4 125 3.527 4 8 62.5 2.283 3.711 16 31.25 1.163 2.46 32 15.625 0.623 1.357 64 7.8125 0.325 0.612 128 3.90625 0.202 0.167 Tael 1a. Hail pemerikaan aorani Urea dengan Douling Dilution.
Faktor Konentrai Grup Meja 3 Grup Meja 5 1 500 4 1.631 3 150 3.756 3.528 10 50 1.468 3.691 30 15 0.628 1.476 100 5 0.168 0.255 300 1.5 0.089 0.139 Tael 1. Hail pemerikaan aorani Urea dengna Decimal Dilution. Faktor Konentrai Grup Meja 2 Grup Meja 4 1 50.00 2.124 1.642 2 25.00 1.485-0.011 4 12.50 0.761 0.214 8 6.25 0.423 0.241 16 3.13 0.255 0.006 32 1.56 0.099 0.046 64 0.78 0.075-0.026 128 0.39 0.056-0.090 Tael 2a. Hail pemerikaan aorani Glukoa dengan Douling Dilution. Faktor Konentrai Grup Meja 2 Grup Meja 4 1 50.00 2.05 1.814 3 15.00 0.68 0.613 10 5.00 0.19 0.185 30 1.50-0.50 0.039 100 0.50-0.08 0.031 300 0.15-0.09 0.000 Tael 2. Tael pemerikaan aorani Glukoa dengan Decimal Dilution. Glukoa Aorani Triglierida Aorani Urea Aorani Blank 0.000 Blank 0.000 Blank 0.000 Standar 0.359 Standar 0.398 Standar 0.230 Darah 0.271 Darah 0.098 Darah 0.256 Tael 3. Tael pemerikaan aorai Glukoa, Triglierida, dan Urea dari ampel darah.
Tael 4. Hail pemerikaan aorani Glukoa, Urea, dan Triglierida kela. Semua hail dicari dengan menggunakan rumu kit.
ANALISA & KESIMPULAN A o r a n i 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Aorani Urea Douling Dilution Meja 3 & Meja 5 y = 0.0274x + 0.2588 R² = 0.9784 y = 0.0825x -0.0593 R² = 0.9902 y = 0.0025x + 1.9357 R² = 0.0842 0 100 200 300 400 500 600 Konentrai (mg/dl) Grup Meja 3 Grup Meja 5 Suet Meja 3 Suet Meja 5 Linear (Grup Meja 5) Linear (Suet Meja 3) Linear (Suet Meja 5) Grafik 1a. Peramaan regrei dan confidence pada Douling Dilution Urea grup meja 3 & meja 5. Dari Tael 1a, dapat diuat grafik eperti diata. Perhitungan regrei dari data-data yang didapat dari Grafik 1a. menunjukkan confidence level (R 2 ) dari meja yang angat rendah 0.0842 dan peramaan gari regrei tereut tidak dapat dipakai karena confidence level yang rendah menunjukkan ketidaklinearan data-data yang ada. menghitung Karena pada hukum Beer-Lamert, Aorani adalah eranding luru dengan Konentrai maka,, untuk mendapatkan peramaan regrei yang memiliki confidence level yang tinggi, hanya data-data yang linear akan kita pakai untuk mencari peramaan regrei. Untuk mencari peramaan regrei yang paling tinggi confidence levelnya, maka dipilih uet data dari meja 3 dan meja 5 yang plaing linear. Pada peramaan regrei yang didapat dari uet meja 3 dan meja 5, kami memilih peramaan regrei meja 3 yang memiliki confidence (R 2 ) yang paling tinggi. y = aorani x = konentrai y = 0.0825x - 0.0593 R² = 0.9902
5 Aorani Decimal Dilution Meja 3 & Meja 5 A o r a n i 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 y = 0.0738x + 0.0714 R² = 0.9841 y = 0.024x + 0.1835 R² = 0.9956 y = 0.0014x + 1.6184 R² = 0.0312 0 0 100 200 300 400 500 600 Konentrai (mg/dl) Grup Meja 3 Grup Meja 5 Suet Meja 3 Suet Meja 5 Linear (Grup Meja 5) Linear (Suet Meja 3) Linear (Suet Meja 5) Grafik 1. Peramaan regrei dan confidence pada Decimal Dilution Urea grup meja 3 & meja 5. Dari Tael 1, dapat diuat grafik eperti diata. Perhitungan regrei dari data-data yang didapat dari Grafik 1. menunjukkan confidence level (R 2 ) dari meja yang angat rendah 0.0312 dan peramaan gari regrei tereut tidak dapat dipakai karena confidence level yang rendah menunjukkan ketidaklinearan data-data yang ada. menghitung Karena pada hukum Beer-Lamert, Aorani adalah eranding luru dengan Konentrai maka,, untuk mendapatkan peramaan regrei yang memiliki confidence level yang tinggi, hanya data-data yang linear akan kita pakai untuk mencari peramaan regrei. Untuk mencari peramaan regrei yang paling tinggi confidence levelnya, maka dipilih uet data dari meja 3 dan meja 5 yang plaing linear. Pada peramaan regrei yang didapat dari uet meja 3 dan meja 5, kami memilih peramaan regrei meja 3 yang memiliki confidence (R 2 ) yang paling tinggi. y = aorani x = konentrai y = 0.024x + 0.1835 R² = 0.9956
Tren pengenceran urea dengan douling dilution pada meja 3 dan 5 yang tidak linear, aik ada douling dilution maupun decimal dilution, ia dieakan eerapa hal: 1. Kealahan pada laeling ampel ehingga aorani ampel alah diaca adalah alah atunya. 2. Penyea lain yang ia menyeakan data-data diata tidak linear euai pengencerannya adalah kontaminai pada reagenia urea yang dipakai ehingga reaki enzimatik tidak terjadi. 3. Bia juga terjadi kealahan pada aat pengenceran pada alah atu larutan dalam rantai douling dilution, mialnya apaila 1:2 terlalu encer, maka pengenceran eterunya juga akan akan terpengaruh. 4. Konentrai urea yang terlalu tinggi ia menyeakan enititifa alat pektofotometer melewati amang ata yang ditentukan dan tidak dapat dikalkulai dengan enar. 2.5 2 A 1.5 o r 1 a n0.5 i Aorani Glukoa Douling Dilution Meja 2 & Meja 4 y = 0.0563x + 0.071 R² = 0.9997 y = 0.0434x + 0.1196 R² = 0.9663 y = 0.0291x -0.1094 R² = 0.7696 0 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00-0.5 Konentrai Glukoa (mm) Meja 2 Meja 4 Suet Meja 2 Linear (Meja 2) Linear (Meja 4) Linear (Suet Meja 2) Grafik 2a. Peramaan regrei dan confidence pada Douling Dilution Urea grup meja 3 & meja 5. Dari Tael 2a, dapat diuat grafik 2a eperti diata. Perhitungan peramaan regrei dari pengenceran glukoa diata. Hail meja 4 memiliki nilai confidence yang cukup tinggi (R 2 = 0.9663), walaupun demikian untuk mencari et fit dengan nilai confidence yang leih tinggi, kami mencoa memuat peramaan regrei dari uet data meja 4 dan erhail menemukan peramaan regrei yang leih aik yakni: y = 0.0563x + 0.071 R² = 0.9997
A o r a n i 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50-0.50 Aorani Glukoa Decimal Dilution Meja 2 & Meja 4 y = 0.0453x -0.1703 R² = 0.9468 y = 0.0364x + 0.0091 R² = 0.9982 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00-1.00 Konentrai Glukoa (mm) Grup Meja 2 Grup Meja 4 Linear (Grup Meja 2) Linear (Grup Meja 4) Grafik 2. Peramaan regrei dan confidence pada Douling Dilution Urea grup meja 3 & meja 5. Dari Tael 2, dapat diuat grafik 2 eperti diata. Perhitungan peramaan regrei dari pengenceran glukoa diata. Dari grafik diata hail peramaan regrei pada meja 4 angat aik dimana nilai R 2 = 0.9982. Ini menunjukan pengenceran yang angat aik. Peramaan regrei yang akan digunakan: y = aorani x = konentrai y = 0.0364x + 0.0091 R² = 0.9982 Pada grafik 2a dan 2, dapat dilihat ahwa data aorani yang euai dengan Hukum Beer-Lamert yang menyatakan ahwa Aorani adalah eanding luru dengan Konentrai. Pada teorinya, diaat konentrai uatu larutan diencerkan menajadi etengah konentrai awalnya, maka aoraninya haru ikut turun menjadi etengah dari aorani konentrai awalnya. Tren ini dapat dilihat pada data-data meja 4 yang cukup linear mengikuti Hukum Beer-Lamert. Ini diuktikan dengan peramaan regrei yang memiliki confidence level (R 2 ) yang mendekati 1. Walaupun egitu, untuk mendapatkan data yang linear ada eerapa faktor yang haru diperhatikan dan dipertimangkan: 1. Pengetahuan mengenai alat pektrofotometer angatlah penting, karena etiap alat memiliki Maximum Detectale Concentration, Minimum Detectale Concentration, Coefficient of
Variation dan Functional Aay Senitivity. Pengetahuan mengenai limitai alat dapat memantu kita merancang jumlah dilui dan konentrai awal. 2. Konentrai larutan tok tidak oleh terlalu tinggi ataupun terlalu rendah. Larutan tok yang terlalu tinggi akan ulit diaca oleh Spektrofotometer atau akan melewati ata makimum deteki yang akan menyakan pemacaan aorani tidak akurat (mialnya, nilai makimal pemacaan aorani adalah 4 yang erarti konentrai 50mM, maka 60mM akan diaca juga eagai aorani 4). 3. Jumlah dilui erial yang akan diuat. Terlalu anyak dilui menyeakan larutan angat encer dan kadang-kadang tidak dapat diaca dengan akurat pada alat pektrofotometer karena erada diamaang ata deteki ata diawah Functional Aay Senitivity. 4. Penggunaan teknik pipet yang aik angat mempengaruhi pengenceran yang tepat. Kealahan yang terjadi pada taung pertama atau kedua pada dilui erial akan menyeakan kealahn pengenceran. Hail-hail peramaan regrei diata akan digunakan untuk memandingkan konentrai pada ampel darah dengan rumu kit yang menggunakan rumu Beer-Lamert GLUKOSA UREA Mh: Anwar Mh: Dorra Mh: Sukaii Mh: Taya Serapan ampel 0.271 0.167 0.147 0.179 Dari grafik1a/2a 3.55 mm 1.71 mm 2.50 mg/dl 2.89 mg/dl Dari grafik 1/2 4.95 mm 2.09 mm -1.52 mg/dl -0.19 mg/dl Dari rumu kit 4.19 mm 3.37 mm 18.04 mg/dl 18.36 mg/dl Tael 5. Hail perhitungan konentrai ampel darah menggunakan peramaan regrei dari grafik 1a/2a & 1/2 dan rumu kit. Dari tael 5 ia kita lihat ahwa konentrai glukoa yang dihitung dari rumu kit ereda dengan dengan peramaan regrei yang kita dapatkan dari grafik 1 dan 2. Ini mungkin dieakan oleh peramaan regrei yang didapat dari uet tidak merepreentaikan eluruh populai dan dieakan oleh itu, hailnya jauh ereda dengan perhitungan rumu kit. Untuk penghitungan konentrai urea, hail yang didapat ereda angat ignifikan diandingkan dengan rumu kit. Ini mungkin dieakan reaki kimiawi pada ampel urea tidak terjadi akiat kontaminai pada reagenia. SARAN 1. Pengetahuan mengenai alat pektrofotometer angatlah penting, karena etiap alat memiliki Maximum Detectale Concentration, Minimum Detectale Concentration, Coefficient of Variation dan Functional Aay Senitivity. Pengetahuan mengenai limitai alat dapat memantu kita merancang jumlah dilui dan konentrai awal. 2. Konentrai larutan tok tidak oleh terlalu tinggi ataupun terlalu rendah. Larutan tok yang terlalu tinggi akan ulit diaca oleh Spektrofotometer atau akan melewati ata makimum deteki yang akan menyakan pemacaan aorani tidak akurat (mialnya, nilai makimal pemacaan aorani adalah 4 yang erarti konentrai 50mM, maka 60mM akan diaca juga eagai aorani 4).
3. Jumlah dilui erial yang akan diuat. Terlalu anyak dilui menyeakan larutan angat encer dan kadang-kadang tidak dapat diaca dengan akurat pada alat pektrofotometer karena erada diamaang ata deteki ata diawah Functional Aay Senitivity.