II. METODOLOGI PENELITIAN 2.1 Metode Pengumpulan Data 2.1.1 Waktu dan tempat penelitian Pengambilan kapsul anggrek hitam (Coelogyne pandurata Lindl.) dan penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan, CV. Gede Ayu Bali Orchid, Kerobokan - Badung pada bulan Desember 2012 Mei 2013. 2.2 Pelaksanaan Penelitian 2.2.1 Pengambilan kapsul anggrek hitam Kapsul yang dipetik berumur 4 bulan dengan ukuran kapsul rata-rata 9 10 cm sebanyak 5 buah (Gambar 1). Gambar 1. Kapsul Anggrek Hitam Umur 4 Bulan 2.2.2 Sterilisasi alat Alat alat yang digunakan yaitu skalpel, pinset, cawan petri dan botol kultur dicuci bersih dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir. Untuk skalpel, pinset, dan cawan petri dikeringanginkan, dibersihkan dengan kapas yang dibasahi dengan alkohol 70%, kemudian dibungkus kertas. Botol kultur dicuci menggunakan detergen (Sunlight), dibilas, dikeringanginkan, ditutup dengan aluminium foil. Selanjutnya botol kultur, skalpel, pinset dan cawan petri disterilisasi dengan autoklaf suhu 121º C pada tekanan 15 psi selama 20 menit. 6
2.2.3 Pembuatan media kultur Media yang digunakan untuk kultur benih anggrek hitam terdiri dari 3 jenis yaitu : media Knudson C (KdC), media W3 dan media organik (O). Pembuatan media Knudson C (KdC) yaitu, ditimbang 79,11 gram bubuk Knudson C, 20 gram gula, dimasukkan dalam labu Erlenmeyer ditambahkan 200 ml aquades, diaduk homogen. Selanjutnya ditambahkan agar 7,5 gram dan aquades hingga volume larutan media mencapai 1 liter, lalu dipanaskan di dalam microwave, diaduk hingga homogen. Setelah media dipanaskan ditambahkan sitokinin (BAP) sebanyak 1 ppm. Diukur ph larutan dengan kertas lakmus menjadi ± 5,8 dengan ditambahkan 1 ml HCl 1 N. Larutan media dituangkan sebanyak 30 ml ke dalam botol kultur steril, lalu ditutup dengan tutup botol yang terbuat dari karet, ditutup aluminium foil dan dibungkus dengan plastik tipis Cling wrap. Media yang kedua yaitu media Western 3 (W3), ditimbang bubuk W3 seberat 18,49 gram, gula 20 gram, dan agar 7,5 gram. Selanjutnya ditambah bubur pisang ambon sebanyak 60 gram. Semua bahan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambah aquades sebanyak 1 liter. Media kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen, selanjutnya ditambahkan sitokinin (BAP) sebanyak 1 ppm. Diukur ph larutan dengan kertas lakmus menjadi ± 5,8 dengan ditambahkan 1 ml HCl 1 N. Larutan media dituangkan sebanyak 30 ml ke dalam botol kultur steril, lalu ditutup dengan tutup botol yang terbuat dari karet, ditutup aluminium foil dan dibungkus dengan plastik tipis Cling wrap. Pembuatan media yang ketiga yaitu media organik (O), yaitu ditimbang gula seberat 20 gram, agar 7,5 gram, arang aktif 0,5 gram, 100 mg (2 butir) vitamin C dan 60 gram bubur pisang ambon. Selanjutnya semua bahan dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer dan ditambahkan air sari kentang sebanyak 150 ml/l, (yang dihasilkan dari 250 gram kentang yang direbus dengan 300 ml air), ditambahkan aquades hingga volume mencapai 1 liter dan aduk hingga homogen. Media kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen. Setelah media dipanaskan ditambahkan sitokinin (BAP) sebanyak 1 ppm. Diukur ph larutan dengan kertas lakmus menjadi ± 5,8 dengan ditambahkan 1 ml HCl 1 N. 7
Larutan media tersebut selanjutnya dituangkan ke dalam botol kultur steril sebanyak 30 ml, lalu ditutup dengan tutup botol yang terbuat dari karet, ditutup aluminium foil dan dibungkus dengan plastik tipis Cling wrap. Botol kultur yang berisi media selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121º C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. 2.2.4 Sterilisasi kapsul anggrek dan penanaman benih anggrek hitam Sebelum digunakan, Laminar Air Flow (LAF) dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Skalpel, pinset, cawan petri, air steril dan alkohol 70% dimasukkan ke dalam LAF, kemudian LAF ditutup dan sinar UV dinyalakan selama 30 menit untuk sterilisasi ruang kultur. Kapsul anggrek dicuci dengan menggunakan detergen (Sunlight), dibilas dengan air mengalir kemudian direndam dalam larutan fungisida Dithane 2 g/100 ml selama 30 menit. Kapsul dibilas sebanyak dua kali dengan menggunakan air steril. Kapsul anggrek steril selanjutnya dimasukkan dalam LAF, direndam dalam alkohol 70% selama 10 detik dan kemudian dibakar di atas api bunsen, kegiatan ini diulang sebanyak tiga kali. Kapsul steril selanjutnya diletakkan di atas cawan petri, kulit luar kapsul anggrek dibelah dan benih anggrek hitam siap ditanam pada media kultur (Gambar 2). Benih diambil dengan pinset steril kemudian ditanam dalam media kultur. Setiap botol berisi lima scoop benih anggrek yang ditebar merata pada seluruh permukaan media. Botol kemudian ditutup dengan tutup karet, dibungkus dengan plastik tipis Cling wrap dan diberi label, dilakukan sebanyak delapan kali ulangan. 8
a. b. c. d. e. Gambar 2. Sterilisasi Kapsul Anggrek dan Penanaman Benih Anggrek Hitam Keterangan : a. Kapsul anggrek direndam dalam alkohol 70% b. Kapsul anggrek dibakar diatas api bunsen c. Pemotongan kulit luar kapsul anggrek hitam d. Benih anggrek hitam yang siap ditanam e. Benih yang telah ditanam di media kultur 9
2.3 Variabel Penelitian Variabel yang diamati pada tahap perkecambahan adalah waktu tumbuh, fase pertumbuhan benih, dan jumlah tunas setiap minggu. 1. Waktu Tumbuh Waktu tumbuh benih anggrek pada media kultur dihitung dengan mendata pada minggu ke berapa sebanyak 25 % benih anggrek berkembang menjadi green embryo. 2. Fase Pertumbuhan Benih Beberapa tahapan (fase) pertumbuhan benih anggrek hitam menurut Semiarti et al., (2010) adalah sebagai berikut : Fase 1 : yellowish embryo Fase 2 : green embryo Fase 3 : first leaf formed embryo Fase 4 : second leaf formed embryo Fase 5 : third leaf formed embryo Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Fase 5 Gambar 3 : Fase Pertumbuhan Benih Anggrek Hitam (Semiarti et al., 2010) Pengamatan fase pertumbuhan benih dilakukan dengan skoring seperti gambar diatas dengan mengamati pertumbuhan pada fase yang dominan ( 75%). 10
3. Jumlah Tunas Jumlah tunas yang telah tumbuh pada media dihitung setiap minggunya untuk mengetahui pertambahan jumlah tunas dari 1 minggu setelah tanam (MST) hingga 12 MST. 2.4 Pengolahan Data Rancangan penelitian yang digunakan untuk perbanyakan anggrek hitam secara kultur in vitro adalah Rancangan Acak Lengkap faktorial dengan 2 faktor yaitu faktor media dan lingkungan. Ada tiga macam media yang dicobakan yaitu media Western 3 (W3), Knudson C (KdC) dan media organik, sedangkan lingkungan tumbuh dibedakan menjadi dua yaitu terang dan gelap. Tiap kombinasi perlakuan terdiri dari 8 ulangan. Data yang diperoleh diolah secara kuantitatif. Data kuantitatif dari waktu tumbuh, fase pertumbuhan benih dan jumlah tunas dari perkecambahan benih anggrek hitam disajikan dalam bentuk gambar. Data kuantitatif diuji secara statistik dengan Analisis of Variance (ANOVA) pada program Costat dan jika berbeda nyata akan diuji dengan uji lanjut Duncan s Multiple Range Test (DMRT) pada tahap 5 %. 11