YOHANES NOVI KURNIAWAN 10702026 KONSTRUKSI DAERAH PENGKODE INTERFERON ALFA-2B (IFNα2B) DAN KLONINGNYA PADA Escherichia coli JM109 Program Studi Sains dan Teknologi Farmasi INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007
Pada kutipan atau saduran skripsi ini harus tercantum nama penulis dan lembaganya yaitu Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
KONSTRUKSI DAERAH PENGKODE INTERFERON ALFA-2B (IFNα2B) DAN KLONINGNYA PADA Escherichia coli JM109 SKRIPSI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains dan teknologi Farmasi dari Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung September 2007 Yohanes Novi Kurniawan 10702026 Debbie S.Retnoningrum Ph.D Pembimbing Utama Dr. Heni Rachmawati Pembimbing Serta Ana Indrayati M.Si Pembimbing Serta
ABSTRAK Hepatitis B dan C kronis merupakan penyakit infeksi yang mematikan dan penyebab utama sirosis serta kanker hati. Saat ini, pengobatan hepatitis B dan C kronis menggunakan kombinasi interferon alfa2b (IFNα2b) dan ribavirin/lamivudine. Terapi pengobatan dengan IFNα2b sangat mahal sehingga jarang digunakan oleh sebagian besar penderita hepatitis B dan C kronis di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis daerah pengkode IFNα2b sintetis menggunakan metode Thermodynamycally Balanced Inside-out (TBIO) bidirectional synthesis berbasis Polymerase Chain Reaction (PCR) dua tahap serta kloningnya ke dalam sel Escherichia coli JM109. Analisis pemotongan ganda menggunakan enzim EcoRI dan HindIII, serta analisis PCR terhadap plasmid rekombinan menunjukkan satu pita berukuran 587 pasangan basa (pb). Analisa penentuan urutan nukleotida terhadap plasmid pgem-t rekombinan menunjukkan 99% nukleotida dari panjang total DNA sisipan dikenali sebagai daerah pengkode IFNα2b sintetis. Hasil ini membuktikan bahwa daerah pengkode IFNα2b sintetis telah diklon ke dalam vektor kloning pgem-t pada sel E. coli JM109. ABSTRACT Chronic hepatitis B and C are lethal infectious diseases and main cause of cirrhosis and liver cancer. Currently, treatment of chronic hepatitis B and C is a combination therapy using interferon alpha2b (IFNα2b) and ribavirin/lamivudine. Therapy using IFNα2b has been still considered to be very expensive; therefore is not commonly used in majority of chronic Hepatitis B and C patients in Indonesia. This research was intended to synthesize a coding region of synthetic IFNα2b using Thermodynamically Balanced Inside-out (TBIO) bidirectional synthesis method based on two steps Polymerase Chain Reaction (PCR) and to clone the synthetic construct of IFNα2b to Escherichia coli JM109. Double cleavage analysis using EcoRI and HindIII and PCR analysis of recombinant plasmid showed one band with approximately 587 base pairs (bps) in size. Sequencing analysis from recombinant plasmid showed about 99% nucleotides from total length of insert DNA were identified as the coding sequence of synthetic IFNα2b. This result proved that coding sequence of synthetic IFNα2b have been cloned in pgem-t vector and maintained in E. coli JM109. i
KATA PENGANTAR Puji dan Syukur dipanjatkan ke hadirat Tuhan Yesus Kristus, berkat kasih dan anugerahnya, maka penelitian Tugas Akhir II dan buku skripsi yang berjudul Konstruksi Daerah Pengkode Interferon Alfa-2b (IFNα2b) dan Kloningnya pada Escherichia coli JM109 dapat terselesaikan dengan baik. Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya disampaikan kepada Debbie S Retnoningrum Ph.D selaku dosen pembimbing utama, Dr. Heni Rachmawati selaku dosen pembimbing serta, Ana Indrayati M.Si selaku dosen pembimbing serta II atas segala bantuan, saran, nasehat, dan dukungan, Bu Ati, Valentina, keluarga terkasih, Virena Ozora, rekan-rekan farmasi 02 dan 03, rekan-rekan laboratorium bioteknologi, rekan-rekan pelayanan PMK dan EE, sahabat-sahabat serta semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan baik secara spiritual maupun material. Akhir kata semoga buku skripsi ini dapat berguna bagi kepentingan akademik. ii
DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK... KATA PENGANTAR... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR TABEL... i ii v vi PENDAHULUAN... 1 BAB 1 TINJAUAN PUSTAKA... 3 1. 1 Pendahuluan Interferon... 3 1. 2 Peranan IFN dalam Pengobatan Hepatitis B dan C... 8 1. 3 Teknologi Sintesis Gen untuk Mensintesis Daerah Pengkode IFNα2b... 11 2 METODE PENELITIAN... 14 3 PERCOBAAN... 15 3. 1 Alat... 15 3. 2 Bahan... 15 3. 3 Perancangan dan Sintesis Oligonukleotida Sintetik Daerah Pengkode IFNα2b sintetis... 16 3. 4 Sintesis dan Amplifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetis... 16 3. 5 Karakterisasi Produk PCR Menggunakan Elektroforesis Agarosa... 17 3. 6 Purifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetis... 17 3. 7 Penentuan Urutan Nukleotida dan Ligasi Produk PCR Hasil Purifikasi... 18 3. 8 Pembuatan Sel Kompeten Escherichia coli JM109... 18 3. 9 Transformasi Hasil Ligasi ke dalam E. coli JM109... 19 3.10 Seleksi dan Karakterisasi Klon Rekombinan... 19 iii
iv BAB Halaman 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN... 21 5 SIMPULAN DAN SARAN.... 32 5.1 Simpulan... 32 5.2 Saran... 32 6 RINGKASAN PENELITIAN... 33 DAFTAR PUSTAKA... 34
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 1. 1 Produksi IFNβ oleh induksi virus... 5 1. 2 Mekanisme kerja IFNα/β... 6 1. 3 Metode recursive PCR... 12 1. 4 Metode sintesis dua arah TBIO... 12 4. 1 Produk PCR tahap 1 (A) dan PCR tahap II (B)... 24 4. 2 Hasil BLAST penentuan urutan nukleotida produk PCR menggunakan primer forward... 25 4. 3 Hasil BLAST penentuan urutan nukleotida produk PCR menggunakan primer reverse... 25 4. 4 Produk PCR yang telah dimurnikan dengan kolom GFX... 26 4. 5 Analisa plasmid rekombinan hasil isolasi lisis cepat (A) dan kit Gene Aid (B)... 27 4. 6 Hasil analisis klon dengan enzim EcoRI (A) dan HindIII (B)... 28 4. 7 Hasil analisis klon dengan pemotongan ganda menggunakan enzim EcoRI + HindIII... 29 4. 8 Hasil analisis plasmid rekombinan dengan PCR... 30 4. 9 Hasil BLAST penentuan urutan nukleotida DNA sisipan plasmid pgem-t 31 v
DAFTAR TABEL Tabel Halaman 4.1 Hasil Rancangan Oligonukleotida... 22 4.2 Karakteristik Hasil Sekuensing Produk PCR... 24 vi
PENDAHULUAN Penyakit kronis hepatitis baik B maupun C adalah penyakit infeksi yang dapat menyebabkan sirosis hati serta kanker hati. Hepatitis C kronis ini sangat penting karena 20-50% dari penderita yang terinfeksi akan berlanjut ke sirosis dan kanker hati. Hepatitis B disebabkan oleh infeksi virus DNA dari keluarga hepadnaviridae dan hepatitis C disebabkan virus RNA dari keluarga flaviridae dan keduanya secara spesifik menginfeksi hepatosit. Pengobatan Hepatitis B dan C dilakukan dengan pemberian vaksin ataupun dengan terapi menggunakan interferon (IFN), antivirus analog nukleosida seperti ribavirin dan lamivudin (Davis, 1998). Pengobatan hepatitis menggunakan IFN telah dilakukan sejak lama. IFN yang digunakan untuk pengobatan kedua hepatitis adalah IFN alfa2b (IFNα2b). IFNα2b yang digunakan untuk pengobatan merupakan produk rekombinan yang diproduksi dalam sel inang Escherichia coli (Davis, 1998). Di Indonesia pengobatan hepatitis B dan C menggunakan IFNα rekombinan masih mahal sehingga penggunaannya masih terbatas, padahal jumlah penderita hepatitis B dan C cukup banyak. Untuk mengatasi kekurangan ini maka dilakukan penelitian yang berfokus kepada sintesis daerah pengkode IFNα2b sintetis untuk selanjutnya diklon ke dalam E. coli dan dilakukan overproduksi menghasilkan protein IFNα2b rekombinan. Kloning daerah pengkode IFNα2b yang digunakan adalah sintetis dan bukan berasal dari cdna yang didapat dari hasil transkripsi balik mrna IFNα2b yang diisolasi dari sel leukosit manusia. Dalam penelitian ini, daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan metode sintesis dua arah TBIO. Sintesis daerah pengkode IFNα2b sintetis 1
2 memiliki berbagai keuntungan dibandingkan dengan cara kloning cdna IFNα2b secara langsung ke dalam sel E. coli. IFN merupakan protein manusia sehingga keuntungan utama yang didapat dengan membuat daerah pengkode sintetis, kodon dapat dioptimasi dengan kecenderungan penggunaan kodon di sel inang, yang dalam hal ini adalah E. coli. Optimasi kodon memungkinkan produksi protein IFN lebih efisien. Keuntungan lain adalah tidak diperlukan cetakan DNA serta memudahkan proses sintesis IFN yang memiliki banyak jenis dengan tingkat kemiripan tinggi.