6 II. MATERI DAN METODE PENELITIAN 1. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi 1.1.1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ubi jalar varietas cilembu, ubi jalar varietas sukuh, media VW, gula, air kelapa, agar, arang, NaOH, HCl dan akuades. 1.1.2. Alat-alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas ukur, labu erlenmeyer, kertas label, kertas merang,cawan petri, alat pengaduk, pipet tetes, sprayer,alat tulis, pinset, ph meter, hot plate and stirrer, alumunium foil, autoklaf, Alkohol 96%, scalpel, pembakar spirtus, timbangan analitik, beker gelas, LAF vertikal. 1.2.Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman selama 5 bulan yaitu sejak bulan Juli hingga November 2013. 2. Metode Penelitian 2.1. Rancangan Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan pemberian bubur ubi jalar dengan varietas yang berbeda yaitu sukuh dan cilembu dengan dosis 0 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 150 g/l, dan 200 g/l, masing-masing perlakuan diulang 3 kali.
7 Volume media yang digunakan untuk setiap perlakuan sub kultur dalam penelitian ini adalah 200 ml, sehingga dosis ubi jalar sukuh dan ubi jalar cilembu yang dibutuhkan yaitu : US0 = Kontrol (tanpa ubi jalar) US1 = Ubi Jalar Sukuh 10 g/200 ml setara dengan 50 g/l ubi jalar sukuh US2 = Ubi Jalar Sukuh 20 g/200 ml setara dengan 100 g/l ubi jalar sukuh US3 = Ubi Jalar Sukuh 30 g/200 ml setara dengan 150 g/l ubi jalar sukuh US4 = Ubi Jalar Sukuh 40 g/200 ml setara dengan 200 g/l ubi jalar sukuh UC1 = Ubi Jalar Cilembu 10 g/200 ml setara dengan 50 g/l ubi jalar cilembu UC2 = Ubi Jalar Cilembu 20 g/200 ml setara dengan 100 g/l ubi jalar cilembu UC3 = Ubi Jalar Cilembu 30 g/200 ml setara dengan 150 g/l ubi jalar cilembu UC4= Ubi Jalar Cilembu 40 g/200 ml setara dengan 200 g/l ubi jalar cilembu 2.2. Variabel dan Parameter Penelitian Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah pertumbuhan bibit anggrek P.amabilis. Parameter yang diukur meliputi jumlah daun pada umur 6 minggu setelah tanam (mst) dan 12 mst, panjang daun terpanjang pada umur 12 mst, jumlah akar pada umur 12 mst, dan panjang akar rata-rata pada umur 12 mst. 2.3.Cara Kerja Penelitian 2.3.1. Pembuatan larutan stok media VW sebanyak 1 liter (10x) Pembuatan larutan stok media VW yaitu dengan cara menimbang komposisi media VW, kemudian bahan-bahan tersebut dilarutkan satu per satu di dalam beker gelas ditambah akuades hingga volume 1000 ml, selanjutnya dihomogenkan (komposisi larutan VW dapat dilihat pada lampiran 1.).
8 2.3.2. Pembuatan bubur ubi jalar 1. Ubi jalar varietas sukuh dan varietas cilembu dibersihkan terlebih dahulu menggunakan air mengalir, kemudian dikupas dan dipotong seperti dadu. 2. Ubi jalar yang sudah dipotong kemudian ditimbang sesuai dengan perlakuan yang diinginkan. 3. Setelah ubi jalar selesai ditimbang, selanjutnya ubi jalar diblender dan ditambah dengan air secukupnya hingga menjadi bubur ubi jalar. 2.3.3. Pembuatan media untuk sub kultur anggrek bulan (Lampiran 2.) 1. Pembuatan media 2000 ml diperlukan sebanyak 200 ml larutan stok media VW, 300 ml air kelapa, dan gula sebanyak 40 g dimasukkan ke dalam beker gelas ukuran 1 liter, kemudian ditambahkan 500 ml aquades hingga volume mencapai 1000 ml sambil di-stirrer. 2. Setelah semua bahan terlarut, media dasar VW dimasukan ke dalam 10 beker gelas yang telah disiapkan masing-masing 100 ml. 3. Masing-masing beker gelas ditambah dengan bubur ubi jalar dengan dosis yang berbeda sesuai dengan perlakuan (US0, US1, US2, US3, US4 dan UC1, UC2, UC3, UC4) kemudian ditambahkan akuades hingga volumenya mencapai 200 ml dan arang 0,4 g selanjutnya dihomogenkan. 4. Media yang sudah homogen diukur phnya dengan menambahkan NaOH atau HCl hingga mencapai nilai ph 5,83.
9 5. Masing-masing beker gelas yang sudah dihomogenkan ditambah 1,6 g agar kemudian dipanaskan dengan menggunakan kompor listrik sambil diaduk hingga mendidih. 6. Setiap beker gelas yang berisi 200 ml media dibagi kedalam 5 botol steril yang berisi ± 40 ml media perlakuan, kemudian ditutup dengan alumunium foil. 7. Media disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit. 2.3.4. Sterilisasi alat Peralatan yang digunakan dicuci terlebih dahulu kemudian dikeringkan. Alat pinset, scalpel dan alat yang terbuat dari gelas misalnya erlenmeyer dan cawan petri dibungkus menggunakan alumunium foil kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 C, 2 atm selama 30 menit. Alat pinset, scalpel disterilisasi kembali pada saat akan digunakan dalam LAF dengan cara membakar ujungnya yang telah dicelupkan dalam alkohol 96% diatas api bunsen hingga ujungnya berwarna merah, selanjutnya didinginkan dengan akuades steril. 2.3.5. Sterilisasi media Botol yang berisi media perlakuan disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 2 atm selama 20menit. 2.3.6. Sterilisasi Laminar Air Flow Sebelum LAF digunakan disterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan lampu ultra violet (UV) selama ± 1 jam. Kemudian LAF
10 disemprot alkohol, alat dan bahan yang akan digunakan disemprot dengan alkohol 96% kemudian dimasukan ke dalam LAF. 2.3.7. Sub kultur anggrek bulan 1. Alat dan bahan yang digunakan dipersiapkan seperti hand sprayer berisi alkohol 96 %, cawan petri yang berisi kertas saring, 2 buah pinset steril, dan scalpel steril. 2. Semua peralatan yang akan digunakan diletakan kedalam laminar air flow yang sebelumnya sudah disemprot dengan alkohol 96%. 3. Bibit anggrek bulan putih diambil dari botol kultur lama menggunakan pinset steril yang dipanaskan dengan api bunsen (flaming) terlebih dahulu, kemudian buka tutup botol pada media yang telah dipersiapkan dengan mulut botol selalu di depan api lampu spiritus, agar bakteri atau spora jamur dapat mati sebelum masuk ke dalam botol. 4. Setiap botol ditanami 3 bibit anggrek bulan. Tutup botol dipanaskan terlebih dahulu pada nyala api beberapa saat sebelum botol ditutup untuk menghindari timbulnya kontaminasi. 5. Botol yang telah terisi bibit anggrek bulan diberi label pada masingmasing perlakuan dan diletakkan pada rak kultur secara teratur. 2.3.8. Pemeliharaan Bibit anggrek P. amabilis yang telah ditanam dalam media perlakuan disimpan dalam ruang inkubasi pada suhu 24-26 0 C, dengan intensitas cahaya yang berasal dari lampu neon sebesar 600-1000 lux yang dinyalakan secara kontinyu selama 24 jam. Pengamatan
11 dilakukan sesuai dengan parameter yang diamati untuk diambil datanya. 3. Pengamatan dan Pengambilan Data 3.1. Jumlah Daun Jumlah daun diamati dan dihitung pada umur 6 mst tanpa mengeluarkan bibit anggrek dari botol kultur dan pada umur 12 mst dengan cara mengeluarkan bibit anggrek dari botol kultur. 3.2. Panjang Daun Terpanjang (cm) Panjang daun diukur dari pangkal hingga ujung daun pada umur 12 mst dengan cara mengeluarkan bibit dari dalam botol dan mengukurnya dengan menggunakan milimeter blok. 3.3. Jumlah Akar Jumlah akar dihitung dan diamati pada umur 12 mst dengan cara mengeluarkan bibit anggrek P. amabilis dari botol kultur. 3.4. Panjang akar rata-rata (cm) Panjang akar rata-rata diamati pada umur 12 mst dengan cara mengeluarkan bibit anggrek P. amabilis dari botol kultur dan diukur dari mulai tempat tumbuh akar/pangkal akar sampai ujung akar menggunakan millimeter blok. 4. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan metode Analisis Ragam (ANOVA) dengan uji F, dengan tingkat kesalahan 5% dan 1%. Apabila hasil penelitian menunjukkan pengaruh yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) dengan tingkat kesalahan 5% dan 1%.