12 III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta mulai bulan Maret sampai dengan Agustus 2009. B. Bahan dan Alat 1. Bahan Eksplan yang dipergunakan dalam penelitian ini berupa 2 aksesi anggrek hasil persilangan, yaitu C1 ( Phalaeonopsis Pinlong Cinderela >< Phalaeonopsis Joanekileup June ) dan C2 ( Vanda tricolor >< Phalaeonopsis Pinlong Cinderela) yang ditumbuhkan dengan media VW, umur 7 bulan dan sebagai bahan adalah tanaman yang akarnya dipotong. Media yang digunakan adalah Vacint and Went (VW), ekstrak kedelai putih 100 gr/liter, ekstrak jagung manis 100 gr/liter, emulsi ikan 4 iter, aquades, sabun cuci, alkohol, dan ZPT Atonik. Emulsi ikan yang dipakai adalah dari jenis emulsi ikan alaska yang banyak mangandung NPK dan asam amino triptofan. Zat tumbuh atonik mengandung bahan aktif natrium arthonitrofenol, natrium paranitrofenol, natrium 2,4, dinitrofenol, 3 IBA (0,057 %) dan natrium 5 nitrogualokal yang dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman. Kandungan atonik adalah gabungan garam natrium dari 5 nitroquiocol dan garam natrium dari para hitrophenol (Kusumo, 1984). 2. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, magnetic stirrer atau hot plate stirrer, ph meter, petridish, gelas ukur, pipet, kapas, tissue, kertas label, peralatan diseksi (pinset besar dan kecil, pisau scalpel dan pemes, gunting eksplan), timbangan analitik dan batang pendorong. 12
13 C. Cara Kerja Penelitian 1. Rancangan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 2 faktor perlakuan, yaitu : Faktor I adalah bahan organik, terdiri dari 3 taraf : K : ekstrak kedelai, J : ekstrak jagung, M : emulsi ikan. Faktor II adalah konsentrasi ZPT atonik, terdiri dari 3 taraf : A1 : Atonik 0 tr, A2 : Atonik 0,5 tr, A3 : Atonik 1 tr. Dari hasil kombinasi 2 faktor diatas, didapat 9 kombinasi perlakuan, dengan masing-masing kombinasi perlakuan diulang sebanyak 4 kali. C1 ( Phalaeonopsis Pinlong Cinderela C2 ( Vanda tricolor >< >< Phalaeonopsis Joanekileup June ) Phalaeonopsis Pinlong Cinderela) CI K A0 : ekstrak kedelai + atonik 0 C2 K A0 : ekstrak kedelai + atonik 0 C1 K A1 : ekstrak kedelai + atonik 0,5 C2 K A1 : ekstrak kedelai + atonik C1 K A2 : ekstrak kedelai + atonik 1 0,5 CI J A0 : ekstrak jagung + atonik 0 C2 K A2 : ekstrak kedelai + atonik 1 C1 J A1 : ekstrak jagung + atonik 0,5 C2 J A0 : ekstrak jagung + atonik 0 C1 J A2 : ekstrak jagung + atonik 1 CI M A0 : emulsi ikan + atonik 0 C2 J A1 : ekstrak jagung + atonik C1 M A1 : emulsi ikan + atonik 0,5 0,5 C1 M A2 : emulsi ikan + atonik 1 : C2 J A2 : ekstrak jagung + atonik 1 C2 M A0 : emulsi ikan + atonik 0 C2 M A1 : emulsi ikan + atonik 0,5 C2 M A2 : emulsi ikan + atonik 1
14 2. Pelaksanaan Penelitian I. Sterilisasi alat Alat-alat yang disterilkan adalah botol kultur, pinset besar dan kecil. Alat-alat tersebut dicuci hingga bersih menggunakan sabun cuci lalu dikeringkan. Setelah kering, dibungkus dengan kertas koran (kecuali botol kultur), kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm 2 selama 45 menit. II. Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan stok dilakukan dengan cara menimbang bahan-bahan kimia sesuai komposisi media VW dan diencerkan dengan aquades steril. Larutan tersebut distirer hingga benar-benar homogen menggunakan magnetic stirrer, lalu dimasukan ke dalam botol dan disimpan pada lemari pendingin. Komposisi media Vacin and Went : Bahan-bahan Jumlah per liter media Stok per 100 ml (10 l media) keterangan Ca 3 (PO4) 2 0,20 g 2 g + *) dicampur kemudian KNO 3 0,525 g 5,25 g* dilarutkan dengan aquadest KH 2 PO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 MnSO 4.2H 2 O MgSO 4.7H 2 O Fe EDTA 0,25 g 0,50 g 0,0075 g 0,25 g 0,028 g 2,5 g* 5 g* 0,075 g* 2,5 g* 0,28 g + hingga 100 ml. Volume stok yang digunakan untuk 1 l media adalah 10 ml. ) Ca 3 (PO 4 ) 2 dilarutkan dahulu dengan HCl 1 N beberapa Sukrosa/Gula 20 g tetes, Fe EDTA dilarutkan Agar 8 g dengan NaOH 1 N beberapa Air Kelapa 150 ml tetes. Masing-masing Aquadest 850 ml dilarutkan dengan aquadest hingga 100 ml. Volume stok yang digunakan untuk 1 l media adalah 10 ml.
15 Sumber : (Gunawan, 1992). III. Pembuatan media Bahan organik ditimbang 100 g kemudian diimbibisi dengan air (perbandingan sama bahan organik : air, dalam wadah dengan tinggi sama) selama 1 malam kemudian direbus. Air untuk imbibisi digunakan untuk merebus bahan organik tersebut. Bahan organik dibiarkan sampai dingin kemudian diblender dan disaring. Sedangkan emulsi ikan bisa langsung digunakan. Seluruh larutan dari garamgaram anorganik, sukrosa dan zat-zat organik dicampur menjadi satu. Kemudian tambahkan agar-agar sebanyak 7 gram dan atonik sesuai dengan konsentrasi perlakuannya. Tambahkan aquades hingga 1000 ml dan ph-nya diatur menjadi 5,3. Pengukuran ph larutan, ph laruatan disesuaikan menjadi 5,3, yaitu dengan penambahan NaOH 1 N untuk menaikkan ph atau HCl 1 N untuk menurunkan ph. Campuran larutan medium tersebut dipanaskan sampai semua agar-agar larut. Setelah itu larutan medium dituang ke dalam tabung reaksi sekitar 2 ml. Tabung ini selanjutnya disterilisasi dengan outoklaf pada tekanan 1,5 lb selama 15 menit. Medium sudah siap ditanami eksplan 3 hari kemudian. IV. Penanaman eksplan Penanaman eksplan dilakukan di dalam LAFC (Laminar Air Flow Cabinet). Alat, botol utama tempat penanaman eksplan, tabung reaksi terlebih dahulu disterilkan dan ditaruh didalam LAFC beberapa hari menjaga kesterilannya. Sebelum dilakukan penanaman tangan disemprot terlebih dahulu dengan menggunakan etanol 96 %, kemudian menggunakan sarung tangan plastik. Tangan dimasukkan kedalam LAFC dan jangan sampai kulit tangan ada yang terbuka didalam LAFC. Sebelum penanaman dimulai, pastikan terlebih dahulu botol utama tidak terkontaminasi jamur. Jika sudah terkontaminasi, botol utama jangan dibuka dan singkirkan. Botol utama yang masih steril, dibuka tutupnya dan mulut botol di lap atau dibersihkan dengan
16 menggunakan kapas yang sudah ditetesi etanol 96 %. Eksplan dipotong akarnya dengan menggunakan pisau scalpel. Masukkan plantlet kedalam mulut tabung reaksi kemudian dorong dengan menggunakan batang pendorong sampai plantlet sedikit terbenam dalam media. Menutup tabung reaksi dengan kapas sampai rapat. V. Pemeliharaan Pemeliharaan tabung reaksi dilakukan dengan cara diletakkan pada rak-rak tabung dengan kondisi ruangan yang diatur pada suhu 18-20 o C menggunakan pendingin ruangan. Penyemprotan menggunakan spirtus atau formalin setiap hari dan dilakukan pengamatan. 3. Variabel Pengamatan a. Saat kemunculan akar pertama plantlet Saat kemunculan akar eksplan diamati sejak dimulai subkultur (HST). b. Panjang daun Panjang daun diamati pada awal penelitian dan akhir penelitian, dilakukan dengan mengukur panjang daun dari ujung daun hingga pangkal tangkai daun (cm). c. Panjang akar Panjang akar diamati pada awal penelitian dan akhir penelitian, dilakukan dengan mengukur panjang akar dari pangkal akar yang berbatasan dengan batang sampai ujung akar (cm). d. Jumlah daun Jumlah daun diamati pada awal penelitian dan akhir penelitian, dilakukan dengan menghitung jumlah daun yang muncul pada setiap eksplan (helai daun). e. Jumlah akar Jumlah akar diamati pada akhir penelitian, dilakukan dengan menghitung jumlah akar yang muncul pada setiap eksplan. 4. Analisis Data
17 Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis ragam dengan Uji F pada taraf 5 %. Jika perlakuan berpengaruh nyata maka dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan s (DMRT) pada taraf 5 %.