3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2011 bertempat di Laboratorium Biologi Mikro 1 untuk identifikasi keong ipong-ipong, Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan. Laboratorium Karakteristik dan Penanganan Hasil Perairan untuk preparasi sampel; Laboratorium Formulasi dan Diversifikasi Hasil Perairan untuk proses perebusan, perebusan garam dan pengukusan keong ipong-ipong; Laboratorium Biokimia Hasil Perairan untuk uji proksimat; dan Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan untuk proses homogenisasi, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Intitut Pertanian Bogor. Laboratorium Pengujian untuk analisis kandungan dan kelarutan mineral keong ipong-ipong, Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Terpadu untuk proses sentrifuse, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong ipong-ipong yang diperoleh dari nelayan perairan Desa Gebang Mekar, Cirebon - Jawa Barat. Bahan-bahan lainnya yang digunakan dalam analisis antara lain: akuades; garam; larutan heksana; tablet kjeltab; H 2 SO 4 pekat; NaOH 40%; H 3 BO 3; indikator bromcherosol green-methyl red; HCl 0,1 N; HNO 3 ; HClO 4; asam sitrat; pereaksi vanadat molibdat; dan kertas saring Whatman no. 42. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cool box, alat bedah, termometer, mortar, timbangan digital, pisau, panci stainless steel, aluminium foil, cawan porselen, oven, desikator, tanur, gelas erlenmenyer, tabung kjeldahl, buret, tabung sokhlet, hot plate, gelas piala, labu takar, gelas ukur, pipet, Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Perkin Elmer AAnalyst 100 tipe flame emmision, spektrofotometer, sentrifuse, dan homogenizer.
16 3.3 Tahap Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam dua bagian. Bagian pertama adalah pengambilan dan preparasi sampel. Bagian kedua adalah proses pengolahan. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 2. Sampel Identifikasi Pengukuran morfometrik Perhitungan rendemen Daging segar Perebusan 100 C, 30 menit Daging rebus Pengukusan 100 C, 45 menit Daging kukus Perebusan garam 100 C, 30 menit, konsentrasi garam 1%;1,5%;2%;2,5%; 3% (b/v) Analisis: 1. Proksimat 2. Kandungan mineral 3. Logam berat 4. Kelarutan mineral Analisis: 1. Proksimat 2. Kandungan mineral 3. Kelarutan mineral Analisis: 1. Proksimat 2. Kandungan mineral 3. Kelarutan mineral Uji hedonik Daging rebus garam (konsentrasi terpilih) Analisis: 1. Proksimat 2. Kandungan mineral 3. Kelarutan mineral Gambar 2 Diagram alir tahapan penelitian; Input/output = ; Proses =. 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Pengambil sampel keong ipong-ipong dilakukan di nelayan Desa Gebang Mekar, yang diambil dari Perairan Desa Gebang Mekar, Cirebon - Jawa Barat. Keong ipong-ipong tersebut kemudian dimasukkan dalam cool box. Sampel dilakukan identifikasi terlebih dahulu (Dance 1977).
17 Sampel sebanyak 30 ekor dilakukan pengukuran morfometrik meliputi berat total, panjang, lebar dan tebal keong ipong-ipong, kemudian dilanjutkan dengan preparasi sampel dimulai dengan cara memecahkan cangkangnya untuk memisahkan daging, jeroan dan cangkang keong (Metusalach 2007). Analisis yang dilakukan pada tahap ini yaitu analisis perhitungan rendemen (Metusalach 2007), analisis proksimat meliputi kadar air, abu, lemak dan protein (AOAC 1995), analisis kadar abu tidak larut asam (SNI 2354.1-2010), analisis kandungan mineral dan logam berat tertentu (APHA 2005), serta analisis kelarutan mineral Ca, Mg, Na dan P (Santoso et al. 2006 modifikasi pelarut air). 3.3.2 Proses pengolahan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui lamanya proses pengolahan. Daging keong yang akan diuji kandungan mineral dan kelarutannya, dimasak terlebih dahulu hingga matang, dilakukan pengecekan tingkat kematangan daging keong ipong-ipong tiap 5 menit sekali. Hasil yang diperoleh dari penelitian pendahuluan adalah keong yang direbus dan rebus garam akan matang pada suhu 100 C selama 30 menit, sedangkan keong yang dikukus matang pada suhu 100 C selama 45 menit. Penelitian pendahuluan selanjutnya adalah penentuan konsentrasi garam pada metode perebusan garam menggunakan uji hedonik. Konsentrasi garam yang digunakan adalah 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; dan 3% (b/v). Uji hedonik parameter rasa dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi garam terhadap tingkat kesukaan panelis. Penimbangan bobot keong dilakukan sebelum dan setelah proses pemasakan untuk mengetahui adanya penambahan atau penyusutan berat keong (Lampiran 1). Analisis yang dilakukan pada keong yang telah mengalami proses pengolahan adalah analisis kadar proksimat (AOAC 1995), kadar abu tidak larut asam (SNI 2354.1-2010), kandungan mineral tertentu (APHA 2005), serta kelarutan mineral Ca, Mg, Na dan P (Santoso et al. 2006 modifikasi pelarut air). 3.3.3 Rancangan percobaan dan analisis data 1) Analisis data uji hedonik Konsentrasi garam untuk proses perebusan garam ditentukan menggunakan uji hedonik. Data yang diperoleh diuji dengan uji nonparametrik Kruskal Wallis.
18 Prosedur pengujian Kruskall Wallis menggunakan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): (1) H = R 3 n 1 T (2) FK = (3) H = H FK Keterangan n i = banyaknya pengamatan tiap perlakuan atau jumlah panelis N = banyaknya data R i = jumlah rata-rata tiap perlakuan ke-i T = banyaknya pengamatan yang seri dalam tiap ulangan H = H terkoreksi FK = faktor terkoreksi Hipotesa terhadap data hasil uji hedonik pada berbagai konsentrasi garam adalah sebagai berikut: H 0 = Konsentrasi garam tidak memberikan pengaruh terhadap rasa keong ipong-ipong. H 1 = Konsentrasi garam memberikan pengaruh terhadap rasa keong ipong-ipong. Apabila hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan di antara perlakuan tersebut memberikan pengaruh nyata terhadap rasa keong ipong-ipong maka pengujian dilanjutkan dengan uji Multiple Comparison dengan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): 1 ; / 1 12 1 Keterangan : R i = rata-rata rangking perlakuan ke-i R j = rata-rata rangking perlakuan ke-j N = banyaknya data K = banyaknya perlakuan n i = jumlah data perlakuan ke-i = jumlah data perlakuan ke-j n j 2) Rancangan percobaan kadar proksimat, kadar abu tak larut asam, kandungan mineral dan kelarutan mineral Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh metode pengolahan terhadap kadar proksimat, kadar abu tidak larut asam, kandungan mineral serta kelarutan mineral keong ipong-ipong adalah metode rancangan acak
19 lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (segar, pengukusan, perebusan, dan perebusan garam). Data dianalisis dengan ANOVA (Analysis Of Variant) menggunakan uji F, sebelum dilakukan uji F terlebih dahulu di uji kenormalan galat. Uji kenormalan galat dengan mengunakan uji Kolmogorov-Smirnov (Lampiran 2). Model rancangannya adalah sebagai berikut: Y ij = μ + τi + ε ij Keterangan : Y ij μ τi ε ij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3,4) = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j Kurva normal yang dihasilkan pada uji Kolmogorov-Smirnov disertakan dengan nilai rata-rata dan standar deviasi (simpangan baku). Nilai rata-rata menggambarkan posisi kurva pada sumbu X, sedangkan standar deviasi menggambarkan sebaran varian. Koefisien keragaman dengan nilai dibawah 50% (median) dinyatakan cukup baik karena dapat membuktikan pada tingkat kepercayaan 95% (Hills dan Little 1998). Suatu data dapat menyebar normal pada: x - z α/2 x + z α/2 (Walpole 1992). Keterangan: x = rata-rata z = 1,96 µ = (1-α) 100% = simpangan baku n = banyak data Koefisien keragaman = Hipotesa terhadap hasil pengujian kadar proksimat, kadar abu tak larut asam, kandungan mineral serta kelarutan mineral keong ipong-ipong pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut: H 0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap kadar proksimat, kadar abu tak larut asam, kandungan mineral serta kelarutan mineral keong ipong-ipong. H 1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap kadar proksimat, kadar abu tak larut asam, kandungan mineral serta kelarutan mineral keong ipong-ipong.
20 Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh terhadap zat gizi keong ipong-ipong, maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan, dengan rumus sebagai berikut: Keterangan : KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan Duncan = tα/2; dbs 3.3.4 Analisis 1) Perhitungan rendemen (Metusalach 2007) Rendemen (yield) merupakan rasio antara bagian tubuh bahan baku yang dapat dimanfaatkan dengan berat total tubuh dan biasanya dinyatakan dalam satuan persen. Perhitungan rendemen Rendemen (%) = Bobot sampel (g) X 100% Bobot awal (g) 2) Analisis proksimat (AOAC 1995) Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk didalamnya analisis kadar air, lemak, protein, dan abu. a) Analisis kadar air Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 C selama 5 jam, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air : % Kadar air = (B1 B2) X 100% B Keterangan: B = berat sampel (gram)
21 B1= berat (sampel+cawan) sebelum dikeringkan B2= berat (sampel+cawan) setelah dikeringkan b) Analisis kadar abu Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 600 C, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 C selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus: Berat abu (g) = berat sampel dan cawan akhir (g) berat cawan kosong (g) Kadar abu (berat basah) = Berat abu (g) X 100% Berat sampel awal c) Analisis kadar protein Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap,yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan satu butir kjeltab dan 3 ml H 2 SO 4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 C selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 C. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : % N = (ml HCl ml Blanko) x N HCl x 14 x Fp X 100% mg contoh % Kadar protein = % N x faktor konversi (fk)
22 Keterangan : Fp = Faktor pengenceran Fk = 6,25 d) Analisis kadar lemak Contoh seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Perhitungan kadar lemak: % Kadar lemak = W3 - W2 X 100% W1 Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak kosong (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3) Analisis kadar abu tak larut asam menurut SNI 2354.1-2010 (BSN 2010) Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10% dan didihkan selama 5 menit. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida (dengan pereaksi AgNO 3 ). Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven. Kertas saring yang sudah dioven kemudian dilipat dengan menggunakan sudip dan diletakkan di dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya. Cawan tersebut dibakar di ruang asam sampai tidak berasap. Cawan kemudian dimasukkan dalam tanur selama 6 jam. Cawan lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu tak larut asam dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut: Berat abu (g) % Kadar abu tidak larut asam = Berat sampel awal (g) 100%
23 4) Analisis kandungan mineral dan logam berat tertentu (APHA 2005) Analisis kandungan mineral meliputi lima mineral makro dan empat mineral mikro. Mineral makro ini di antaranya kalsium (Ca), natrium (Na), kalium (K), magnesium (Mg) dan fosfor (P), sedangkan mineral mikro yang dianalisis yaitu besi (Fe), seng (Zn), selenium (Se), dan tembaga (Cu). Analisis logam berat meliputi merkuri (Hg) dan timbal (Pb). a) Analisis kandungan mineral (Ca, Na, K, Mg, Fe, Zn, Se, Cu) dan logam berat (Hg dan Pb) Prinsip pengujian total mineral yaitu mengetahui nilai absorpsi logam dengan menggunakan metode Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml. Sampel dalam labu ditambahkan 5 ml HNO 3 65%. Labu ditempatkan di atas hot plate sampai semua sampel larut. Sampel dibiarkan dingin kemudian ditambahkan HClO 4 sebanyak 2 ml. Labu kembali ditempatkan di atas hot plate sampai asap dalam labu takar hilang. Larutan kemudian diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring Whatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Perkin Elmer AAnalyst 100 tipe flame emmision dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral, kemudian diukur absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah Keterangan: fp = faktor pengencer Kadar mineral= b) Analisis kandungan fosfor Prinsip pengujian fosfor yaitu mengetahui nilai absorpsi logam fosfor dengan menggunakan metode Spektrofotometri. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml. Sampel dalam labu
24 ditambahkan 140 ml asam sitrat. Labu ditempatkan di atas hot plate sampai semua sampel larut. Sampel dibiarkan dingin kemudian ditambahkan HClO 4 sebanyak 2 ml. Labu kembali ditempatkan di atas hot plate sampai asap dalam labu takar hilang. Larutan kemudian ditambahkan 25 ml pereaksi vanadat molibdat kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring Whatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Selanjutnya sampel didiamkan selama 10 menit. Sejumlah larutan stok standar dari mineral fosfor diencerkan dengan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh diukur ke dalam spektrofotometer dengan panjang gelombang 650 nm. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah Keterangan: fp = faktor pengencer Kadar mineral= 5) Analisis kelarutan mineral (Santoso et al. 2006 modifikasi pelarut air) Analisis kelarutan mineral diuji pada mineral kalsium, kalium, magnesium dan fosfor. Sampel yang telah diberi perlakuan pengolahan dan kontrol dihomogenkan terlebih dahulu lalu diambil 10 gram untuk dianalisis dan ditambahkan 40 ml air lalu homogenizer pada kecepatan 5.000-10.000 rpm selama 2 menit untuk fraksi terlarut. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 7.000 rpm, 2 C selama 10 menit. Hasil dari sentrifugasi selanjutnya disaring menggunakan kertas saring Whatman no. 42. Supernatan diukur sebagai mineral terlarut menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Perkin Elmer AAnalyst 100 tipe flame emission (kalsium, natrium dan magnesium) dan spektrofotometer (fosfor). Perhitungan kelarutan mineral (%) % Kelarutan mineral = A X 100% B Keterangan: A = Kandungan mineral yang larut dalam media pelarut air (mg/ 100 g bk) B = Kandungan mineral awal (mg/ 100 g bk)