BAB 4. SPEKTROFOMETRI Salah satu sifat benda adalah warnanya. Benda dapat berwarna oleh karena kemampuannya menyerap, meneruskan, atau memantulkan komponen komponen warna dan cahaya atau sinar yang melaluinya. Misalnya seseorang melihat satu gelas sirup berwarna merah. Ini disebabkan oleh karena komponen-komponen biru dan kuning dan cahaya putih yang melalui sirup tersebut diambil/diserap dan yang diteruskan hanya komponen merahnya saja. Oleh karena itu sirup lalu berwarna merah. Sifat demikian juga berlaku untuk komponen-komponen kimiawi penyusun suatu bahan. Oleh akrena intensitas cahaya dapat diukur, maka atas dasar tersebut dapat digunakan sebagai dasar untuk analisis suatu komponen baik secara kualitatif mau pun secara kuantitatif. Cahaya dapat diartikan sebagai gelombang elektromagnetik. Sebagian (kecil) dapat ditangkap oleh mata manusia dan sebagian (besar) tidak dapat. Yang dapat ditangkap oleh mata adalah spektrum cahaya yang berada pada panjang gelombang 400-800nm. Dekat dengan panjang gelombang 400nm tetapi berada di bawahnya adalah spektrum ultra violet (UV) yang umumnya berkisar pada panjang gelombang 200-400nm, sedangkan dekat dengan panjang gelombang 800nm tetapi berada di atasnya merupakan spektrum cahaya mendekati infra merah (near infra red, NIR). Gambaran spektrum cahaya kurang lebih seperti berikut mi. Untuk keperluan analisis panjang gelombang antara 200-800nm adalah yang paling sering digunakan. Beberapa metoda dan untuk keperluan khusus menggunakan panjang gelombang infra merah dan NIR. 4-1 TEORI DASAR Jika cahaya diasumsikan sebagai fenomena gelombang, maka akan tampak gambaran seperti berikut ini.
Jarak antara dua puncak dan simpulnya adalah panjang gelombang yang diberi simbol Jumlah gelombang yang melalui suatu titik (interval) per unit waktu adalah frekuensi.ג (v). Hubungan antara panjang gelombang dengan frekuensi dapat diformulasikan sebagai berikut: c adalah kecepatan cahaya. Parameter lain yang juga berguna adalah jumlah gelombang cahaya per unit jarak yang diberi simbol. Hubungan masing-masing diformulasikan sebagai berikut: Sementara itu hubungan antara energi dan frekuensi adalah: h adalah konstanta Plank. Jika cahaya melalui suatu substansi tertentu, maka sejumlah energi akan dialihkan pada sampel yang akan meningkatkan keadaan elektronnya ke suatu tingkat energi tinggi. Perubahan transisi molekular ini bertingkat dan elektronik, vibrasi sampai pada rotasi, memerlukan energi yang makin tinggi. Panjang gelombang suatu cahaya mempunyai peranan pada transisi ini dan dapat dikalkulasi melalui formula:
Spektrum tampak (visible) dan ultra violet berasosiasi hanya dengan transisi elektronik. Pada molekul senyawa organik, molekul ini meningkatkan sebanyak π elektron. Eksitasi (perangsangan) dari π elektro tunggal mengabsorpsi sangat sedikit cahaya tampak, tetapi jika π elektronnya meningkat, maka absorbansinya juga akan meningkat. Lima atau lebih dari π elektron dan sistem cincin benzena atau tujuh dan π elektron dan sistem konyugasi tunggal akan menghasilkan absorbansi sinar tampak nyata. Dengan demikian jumlah energi (panjang gelombang cahaya) yang terabsorbsi oleh suatu molekul dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi secara kualitatif dan kuantitatif. Hal ini diperkenalkan oleh seorang ahli di bidang ini yang bernama Bouquer pada tahun 1729. Ia menggunakan satu seri tabung yang berisi penuh suatu material yang mempunyai sifat mengadsorpsi dan mengukur jumlah cahaya yang ditransmisikan. Ia mengasumsikan insiden radiasi yang terjadi pada sel pertama mempunyai nilai 1,0, maka hanya 50% yang ditranmisikan oleh cahaya tersebut. Selanjutnya pada sel berikutnya hanya 25% yang ditransmisikan (atau 50% dan cahaya yang ditransmisi oleh sel pertama), dan hanya 12,5% yang ditransmisikan oleh sel ketiga (atau 50% dan ahaya yang ditransmisi oleh sel kedua), demikian seterusnya dalam gambar dan formulasi sebagai berikut: a adalah koefisein absorpsi semacam a pada formula sebelumnya, b adalah panjang cahaya dan c adalah konsentrasi materi yang mengadsorpsi cahaya. Meski pun pada permulaan penemuannya digunakan transmitan (T) untuk pengukuran adsorpsi, tetapi dalam pengembangannya digunakan absorbasi (A) dan optical density (OD). Hubungan antara absorbansi dengan tranmitansi adalah sebagai berikut: demikian juga dalam pengembangan selanjutnya menjadi absorbansi tersebut, konstanta asorpsi tidak digunakan lagi melainkan diganti dengan konstanta ekstingsi
(ε), yaitu besarnya absorbansi 1M larutan suatu komponen murni pada pelarut, suhu dan panjang gelombang standar (tertentu). Oleh karena merupakan pengembangan antara absorbansi dan tranmitansi, maka pengembangan formulasi ini dikenal dengan hukum Bonguer-Beer, yaitu: Penggunaan hukum Bonguer-Beer tersebut dalam contoh sebagai berikut. Hitung koefisien ekstingsi NADH jika larutan 1,37x1O -4 M memberikan absornasi 0,85 pada panjang gelombang 340nm di dalam tabung (sel) 1 cm. Dengan menggunakan A = ε bc akan diperoleh mengsubstitusikan data yang ada akan diperoleh: = maka dengan Tiap bahan (komponen) mempunyai karakteristik serapan warna sinar yang spesifik, berbeda antara satu dengan yang lain. Untuk mengidentifikasikan karakteristiknya dapat dikerjakan dengan mengamati besarnya absorbansi pada tiap panjang gelombang pada sinar tampak. Cara ini dinamakan scanning. Alat untuk scanning ini
T adalah trnasmitan dan I adalah jumlah energi radian (cahaya) yang ditransmisikan oleh sel, sedangkan adalah jumlah energi radian yang datang (mengenai) sel. Dari berbagai data yang dikumpulkan melalui penerlitian-penelitian, secara matematik kemudian diperoleh: e adalah angka dasar pada logaritma natur, α adalah konstanta yang besarnya spesifik untuk setiap bahan dan disebut sebagai koefisien absorbsi, b adlah panjang gelombang yang melalui material. Pada akhirnya ahli lain, Beer, mengembangkan penelitian yang analog tetapi mendiskripsikan dalam ukuran konsentrasi sebagai berikut: sekarang sudah dikembangkan untuk dapat dioperasikan secara otomatik yaitu scanning spectrophotometer. Dengan cara ini, karetonoida misalnya mempunyai karakteristik absorbansi maksimum pada panjang gelombang 480nm, sedangkan xantofil mempunyai karakteristik absorbansi maksimum pada tiga panjang gelombang yaitu 48nm, 449nm, dan 422nm. 422 449 480 481
Hal tersebut menimbulkan pertanyaan bagaimana dengan absorbansi suatu campuran berbagai komponen. Ternyata secara matematik: Untuk bahan berupa campuran beberapa komponen, maka tiap komponen dalam campuran tersebut dapat dianggap sebagai komponen murni. Tiap-tiap komponen murni tersebut dapat diketahui katrakteristik absorbansinya dengan menganalisis pada sebanyak panjang gelombang yang berbeda. Kemudian setelah itu absorbansi campuran didertminasi pada panjang gelombang yang sama. Dan formula di atas dapat dikembangkan: A n adalah absorbansi campuran pada setiap panjang gelombang sebanyak n kali, adalah koefisien ekstingsi dari komponen murni yang ke n pada panjang gelombang yang ke n. Simbol c 1, c 2,.c n adalah konstanta, sedangkan b dapat diketahui dengan menggunakan sel yang panjangnya 1 cm, sementara A 1,A 2, A n dan semua koefisien ekstingsi diukur secara langsung. Meski pun demikian dalam praktek hal ini jarang dikerjakan, dan perlu diperhatikan dua hal berikut ini: 1. Diperlukan pengetahuan tentang komposisi campuran secara cermat. 2. Kemampuan dapat digunakannya tiap komponen dalam keadaan murni. 4-2 SPEKTROFOTOMETER Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk mendeteksi transmitan atau absorban cahaya yang melewati suatu material (bahan). Dapat pula disebut dengan kalimat lain, spektrofotometer adalah instrumen yang digunakan untuk mempelajari absorbsi atau emisi radian elektromagnetik sebagai fungsi dan panjang gelombang.
Spektrofotometer juga sering disebut sebagai sektrofotometer saja. Komponenkomponen spektrofotometer adalah: 1. Sumber energi radian yang stabil 2. Sistem lensa terdiri atas kaca, dan slit (lubang kecil) dan kolimat (lensa untuk merubah jalannya cahaya menjadi paralel) dan pemfokes cahaya 3. Tabung (tempat, wadah) yang tembus cahaya (transparan) untuk menempatkan sampel 4. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan rekorder yang dapat memberikan data yang dapat dibaca. Butir 2 dan butir 3 sering digabung menjadi satu bagain yaitu yang dinamakan monokromator. Jika digambarkan dalam bentuk blok (disebut pula black-box atau twiddle-the knobs) adalah sebagal berikut: Sumber cahaya Sumber cahaya dapat merupakan material yang menghasilkan energi tinggi dengan suatu voltase listrik yang tinggi atau dengan pemanasan elektrik. Besarnya energi yang dapat dihasilkan tergantung pada beberapa faktor. Beberapa energi ini akan mempengaruhi panjang gelombang. Jika energi berubah-ubah, maka panjang gelombang yang dihasilkan juga akan berubah-ubah. Kontinuitas energi yang besarnya konstan adalah yang terbaik karena panjang gelombang yang dihasilkan akan juga tetap. Oleh karena itu perubahan energi elektrik yang menghasilkan energi akan dapat merubah besarnya energi yang dihasilkan. Konsekuensinya diperlukan suatu suplai tenaga yang stabil untuk keperluan tersebut. Faktor-faktor lain yang berpengaruh adalah besarnya intensitas cahaya, waktu pengukuran, intensitas cahaya yang ditransmisikan (termasuk pula jenis alat) akan menyebabkan error (penyimpangan) pada pengukuran. Ada beberapa macam sumber cahaya, yang populer tiga macam yaitu sumber cahaya radian ultra ungu (violet), sumber radian tampak, dan sumber radian infra merah. Sumber cahaya ultra ungu. Pada umumnya digunakan lampu hidrogen atau lampu deuterium. Lampu ini terdiri atas sepasang elektroda yang ditempatkan dalam suatu tabung kaca yang berisi gas hidrogen atau deuterium pada tahanan rendah. Jika
voltase tinggi yang stabil dintroduksikan pada elektrode-elektrode tersebut, maka elektron akan keluar ke dalam molekul-molekul gas pada keadaan tingkat energi tinggi. Jika elektron tersebut kembali pada keadaan semula, maka menimbulkan cahaya yang secara terus menerus dapat terjadi pada daerah panjang gelombang antara 180-350nm (beberapa ahli berpendapat antara 200-400nm). Jenis lampu lain yang dapat digunakan sebagai sumber radian ultra ungu adalah lampu xenon, tetapi jenis lampu ini masih mengeluarkan sinai tampak walau pun sedikit dan tidak sestabil lampu hidrogen. Sumber cahaya tampak yang paling banyak digunakan adalah lampu tungsten, jenis lampu ini dapat digunakan pula sebagai sumber cahaya NIR (near infra red). Secara terus menerus cahaya ini dapat terjadi pada daerah panjang gelombang antara 300nm (400nm) sampai dengan 2500nm. Sumber cahaya infra merah. Lampu Globar atau lampu Nerst adalah jenis yang dapat menghasilkan cahaya infra merah. Jenis lampu ini berbentuk bulat dan silikon karbida yang dipanaskan pada suhu 1200 0 C. Cahaya ini dapat timbul pada daerah 1-40µm. Lampu Nerst berbentuk bulat lonjong dari zirkonium atau yttrium oksida yang dipanaskan pada suhu sekitar 1500 0 C dengan energi listrik. Daerah radiasinya adalah O,4-2Oµm. Lampu Nerst kurang stabil dibandingkan dengan lampu Globar. Monokromator Telah diketahui bahwa sumber cahaya yang idel adalah yang dapat mengeluarkan suatu spektrum yang.tinggi serta secara terus menerus dan intensitasnya seragam pada suatu interval panjang gelombang yang dikehendaki. Tetapi dalam praktek sukar dijumpai keadaan demikian seperti tampak pada gambar berikut ini.
Di dalam pemanfaatannya untuk pengukuran interval panjang gelombang yang pendek lebih menguntungkan daripada pada panjang gelombang yang panjang. Keuntungan yang dimaksud adalah sebagai berikut: a. Interval pendek memungkinkan reduksi pita-pita absorpsi menjadi berdekatan satu dengan yang lain. b. Dengan interval pendek, suatu puncak dapat diukur pada keadaan absorpsi maksimum sehingga menaikkan sensitifitasnya. c. Dengan interval pendek, absorpsi cenderung menunjukkan penyesuaian dengan hukum Beer, sebab hanya radiasi yang diabsorpsi tersebut yang diukur. Oleh karena itu diperlukan sesuatu yang dapat digunakan untuk mengubah radiasi polielektromagnetik suatu cahaya menjadi pita-pita yang pendek atau radiasi monokromatik. Ada dua macam alat yang dapat digunakan, yaitu filter dan monokromator. Filter dibuat dari material spesial yang memungkinkan transmisi hanya berada pada daerah panjang gelombang tertentu, sementara pada daerah di luar itu radiasinya diserap. Pada umumnya filter mempunyai lebar pita aktif yang lebarnya (intervalnya) antara 20-5Onm. Lebar pita aktiv didefinisikan sebagai interval panjang gelombang yang menghasilkan nilai maksimum pada separuh tranmitan. Monokromator merupakan alat yang juga dapat memungkinkan transisi harga berada pada daerah panjang gelombang tertentu, yaitu mengubah radiasi polikromatik menjadi radiasi monokromatik di antara lebar pita aktiv antara O,1-35nm. Meski pun demikian, monokromator harganya mahal sehingga filter Iebih banyak digunakan dalam praktek. Komponen-komponen monokromator adalah: a. Slit sebagai jalan masuk radiasi polikromatik dan suatu sumber cahaya
b. Kolimat yang berupa lensa atau cermin yang mengubah arah cahaya dan tidak sejajar menjadi sejajar c. Prisma yang akan memisahkan masing-masing panjang gelombang d. Lensa yang berfungsi untuk memfokuskan cahaya e. Slit sebagai jalan keluar radiasi mokromatik Secara skematik, monomromator dapat digambarkan seperti pada gambar berikut ini. Detektor Detektor adalah alat yang dapat mendeteksi komponen yang diukur secara kualitatif mau pun kuantitatif. Pada umumnya merupakan suatu sinyal elektronik yang diteruskan pada suatu meter atau rekorder. Detektor yang baik jika: a. Mempunyai sensitifitas tinggi dengan noise rendah meski pun dengan tenaga radian rendah b. Mempunyai waktu respon pendek c. Mempunyai stabilitas panjang pada saat pengukuran kuantitatif d. Mempunyai sinyal elektrik yang mudah dibaca langsung dengan suatu alat. Ada beberapa macam detektor, yaitu detektor ultra violet dan visibel, detektor tabung foto tunggal (photo tube detector), detektor tabung foto majemuk (photo multiple tube detector), detektor near infra red (NIR), dan detektor middle and far infra red. 4-3 PENANGANAN SAMPEL Tiga hal yang perlu diperhatikan pada pengukuran sampel, yaitu wadah untuk sampel, pelarut, dan preparasi sampel. Wadah sampel- Untuk sampel yang akan diperiksa (diuji) pada daerah ultra violet dan daerah sinai tampak umumnya berupa gas atau larutan yang diletakkan di dalam suatu tabung (sel) atau kuvet. Untuk pengujian di daerah ultra violet digunakan kuvet yang
terbuat dan bahan quartz sedangkan untuk pengujian di daerah sinar tampak digunakan kuvet yang terbuat dan kaca biasa atau dan bahan quartz. Untuk sampel berupa gas, digunakan tabung (sel) yang panjangnya bervaniasi antara 0, 1-10mm, sementara untuk sampel berupa larutan diunakan kuvet yang panjangnya bervariasi antara 1-10cm. Tabung atau kuvet harus dijaga kebersihannya. Bekas jari atau sisasisa sampel sebelumnya akan menyebabkan error pada pengukuran. Tabung atau kuvet harus dicuci sampai bersih dengan aquades atau dengan larutan pencuci larutan asam nitrat panas. Pelarut. - Syarat pelarut yang dapat digunakan untuk spektrofotometri adalah: a. Harus dapat melarutkan sampel b. Harus dapat mentransmisikan cahaya pada panjang gelombang yang dikehendaki Untuk keperluan pengukuran pada daerah ultra violet umumnya digunakan pelarutpelarut seperti pada tabel berikut ini. Panjang gelombang terendah yang ultra violet dapat ditransmisikan pada daerah ultra violet Sementara pelarut yang digunakan untuk pengukuran di infra merah adalah sebagai berikut.
Preparasi sampel - Komponen-komponen yang akan diukur pada daerah ultra violet dan sinar tampak sering menghambat absorpsi molar pada absorbansi maksimum. Konsentrasi yang tinggi menyebabkan hasil transmitan yang rendah atau absorbansi tinggi. Sebaliknya konsentrasi yang terlalu rendah menyebabkan asil tansmitan yang tinggi atau absorbansi rendah. Oleh karena itu harus diusahakan agar supaya konsentrasi sampel dapat memberikan transmitan yang optimal yaitu antara 20-65%.
Konsekuensinya sering sampel harus diencerkan supaya dapat memberikan absorbansi pada daerah optimum. Sementara itu pengukuran pada daerah infra merah, panjang sinar di daerah sel umumnya sangat pendek dan pita absorbsi infra merah mempunyai absorpsifitas molar yang lebih pendek. Konsekuensinya larutan yang pekat diperlukan untuk dapat diukur absorbansinya. Umumnya konsentrasi 0,5-10% sering digunakan, tetapi pengukuran di daerah infra merah secara kuantitatif lebih kurang akurat, dan karena hanya menggunakan energi cahaya infra merah yang rendah adalah sukar memperoleh transmitan yang sesungguhnya. 4-4 MACAM-MACAM SPEKTROFOTOMETER Berdasarkan sumber cahaya (energi) yang digunakan dikelompokkan dua macam tipe spektrofotometer, yaitu single-beam spectrophotometer dan bouble-beam spectrophotometer. Perbedaan antara keduanya adalah: a. Pada single-beam spectrophotometer : radiasi berasal dari satu sumber masuk ke dalam monokromator yang akan didispersikan ke prisma. Radiasi akan melalui sel dan diteruskan ke detektor b. Pada double-beam spectrophotometer: radiasi berasal dan dua alur sinar-, yaitu satu langsung melalui sel blanko dan yang lain melalui sel sampel. Berdasarkan penggunaannya pada daerah pengukuran, dikenal tipe-tipe spektrofotometer ultra violet visibel (UV-VIS), ultra violet (UV), visibel, dan infra merah (IR). Berdasarkan kekhususannya dalam penggunaan dikenal pula spektrofotometer emisi pembakaran (flame emmissiori spectrophotometet, spektrofluorofotometer, atomic absorption spectrophotometer (AAS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectrophotometer, dan mass spectrophotometer. 4-5 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI 1. Apa yang mendasari analisis komponen dengan menggunakan metoda spektrofotometri? 2. Terangkan fenomena yang diperoleh dari percobaan Bouquer! 3. Pada analisis protein larut dengan metoda Lowry, diperlukan larutan standar bovine serum albumine (BM 68) yang dipreparasi dengan konsentrasi 100mg/ml. Pada saat pengukuran dengan spektrofotometer UV-VIS pada
panjang gelombang 690nm menghasilkan absorbansi 0,932 jika menggunakan kuvet setebal 1 cm. Hitung koefisien ekstingsinya! 4. Scanning larutan bovine serum albumine (BSA) memperoleh spektrogram dengan dua puncak, yaitu pada panjang gelombang 500nm dan 690nm. Jelaskan arti dari spektrogram tersebut! 5. Fasilitas apa saja yang harus ada supaya spektrofotometer dapat dioperasikan? 6. Kapan filter dan monokromator digunakan? 7. Sumber cahaya apa saja yang dapat digunakan pada spektrofotometer, dan apa saja karakteristikanya? 8. Jelaskan bagaimana sampel diperlakukan supaya dapat diuji dengan metoda spektrofotometeri! 9. Apa fungsi AAS dan NMR spectrophotometer?