Kolokium Delvi Riana G34080010 Delvi Riana, Achmad Farajallah, dan Muladno. 2011. Diversitas Genetik Domba yang Tahan terhadap Infeksi Cacing Parasit berdasarkan mtdna Ruas Dloop dan Gen SRY. Kolokium disampaikan tanggal 10 Nopember 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB. PENDAHULUAN Latar Belakang Domba lokal Indonesia dikelompokkan dan dinamai berdasarkan morfologi dan daerah asalnya. Ada domba Madura, domba Indramayu, domba Sumbawa, domba Rote, domba kisar, dan domba Donggala (Sumantri et al. 2007); domba Jawa Ekor Tipis, domba Jawa Ekor Gemuk, dan domba Sumatra Ekor Tipis (Romjali et al. 1996; Robert et al. 1997); dan domba Garut (Priangan) (Mason et al. 1980). Tetapi domba lokal yang paling dikenal oleh masyarakat adalah domba Ekor Gemuk, domba Ekor Tipis dan domba Garut (Mason 1980; Utoyo et al. 1996; Mulliadi 1996). Domba merupakan hewan hasil domestikasi yang memiliki peran penting bagi kehidupan manusia. Daging dan susu domba dikonsumsi oleh manusia untuk memenuhi kebutuhan protein. Namun seiring dengan pengembangbiakannya domba mudah terinfeksi oleh cacing parasit. Cacing yang parasit pada hewan ternak dapat menyebabkan kerugian seperti penurunan berat badan, penurunan kualitas daging, kulit, dan jerohan, penurunan produktivitas ternak sebagai tenaga kerja pada ternak potong dan kerja, penurunan produksi susu pada ternak perah dan bahaya penularan pada manusia. Berdasarkan penelitian sebelumnya ada sampel domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit setelah diberi perlakuan dosis tertentu obat cacing dan beberapa sampel domba terinfeksi cacing tidak terpengaruh pemberian obat cacing. Dalam penelitian yang direncanakan ini, pengusul akan mengaplikasikan metode DNA Barcode berdasarkan gen DNA Mitokondria ruas Dloop untuk asal usul domba secara maternal dan XRY gen untuk asal usul domba secara paternal. DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). page 1 / 18
DNA mitokondria (mtdna) telah secara luas digunakan sebagai penanda evolusioner untuk studi Phylogeographic dan pola Phylogenetic (Tapio& Grigaliunaite 2002). Analisis sikuen MtDNA digunakan untuk studi taksonomi dengan ukuran sampel yang kecil karena bermutasi 5-10 kali lebih cepat dibandingkan DNA inti ( Wu et al. 2003). Kelebihan MtDNA antara lain bersifat haploid, tidak ada rekombinan, memiliki jumlah copi yang banyak, dan diturunkan secara maternal (maternal inherited) (Pidancier et al. 2006). MtDNA juga telah digunakan untuk menjelaskan kompleksitas dan asal usul berbagai ternak modern yang telah didomestikasi berdasarkan Maternal Lineages (Meadows et al. 2007). Ruas kontrol non coding Dloop pada mtdna merupakan ruas yang memiliki laju mutasi tinggi dibandingkan ruas gen mtdna yang lain. Ruas Dloop mengandung sekitar 300 bp. Perbedaan laju mutasi menyebabkan ruas Dloop lebih cocok sebagai penanda molekuler untuk intra spesies. Ruas yang banyak mengalami substitusi nukleotida kurang baik digunakan sebagai penanda molekuler antar spesies, sebab dapat meningkatkan nilai standar error (Firdhausi 2010). Penentuan jenis kelamin pada mamalia terkait dengan keberadaan kromosom Y yang mempunyai ruas gen dominan untuk pembentukan testis. Gen ini bertindak sebagai faktor penentu untuk pembeda jenis kelamin pada mamalia (Muttaqin 2010). Y kromosom berguna untuk studi filogeni yang diturunkan secara paternal ( paternal inherited) dan dengan pengecualian wilayah pseudoautosomal, tidak mengalami rekombinasi homolog pada meiosis (Pidancier et al 2006). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi filogeni dan diversitas genetik domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit berdasarkan mtdna ruas kontrol non coding D-Loop dan gen SRY. page 2 / 18
Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juni 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. BAHAN DAN METODE Sampel Darah Domba Darah dari 36 domba terdiri atas domba Ekor Tipis dan domba Ekor Gemuk yang berasal dari berbagai daerah di Pulau Jawa merupakan koleksi dari Prof. Muladno IPB. Sampel darah (whole blood) diambil sebanyak 1-1,5 ml disimpan dalam alkohol 70 % dengan volume minimum 2x volume sampel. Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel yang digunakan sebagai sumber DNA adalah dari sel darah (whole blood). Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal blood (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA page 3 / 18
Amplifikasi ruas non coding D-loop mtdna dan gen SRY akan dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang akan digunakan adalah primer spesifik yang mengenali ruas D-loop dan gen SRY sebagai DNA barcode pada mamalia ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik. Pengoptimasian akan dilakukan terhadap suhu penempelan dan berbagai konsentrasi pereaksi PCR. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing. Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilmaid dan berukuran sesuai desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genebank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data spesies domba yang terdapat pada Genebank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbor joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. RENCANA PENELITIAN page 4 / 18
DAFTAR PUSTAKA Firdhausi NF. 2010. Asal usul sapi madura berdasarkan penanda DNA mitokondria [tesis]. Bogor. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Mason IL. 1980. Prolific tropical sheep. FAO animal production and healt paper 17. FAO and UNEP 1980.Rome. Meadows JRS, Cemal I, Karaca O, Gootwine E, Kijas JW. 2007. Five ovine mitochondrial lineages identified from sheep breeds of the near east. Genetic. 175:1371-1379. Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Mulliadi ND. 1996. Sifat fenotipik domba Priangan di Kabupaten Pandeglang dan Garut. [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Muttaqin WN. 2010. Philogeny and genetic diversity of indonesian local sheep based on mitochondrial DNA control region and SRY gene [tesis]. Bogor. Program Pacsasarjana, Institut Pertanian Bogor. Pidancier N, Jordan S, Luikart G, Taberlet P. 2006. Evolutionary history of the genus page 5 / 18
Capra (mammalia, artiodactyla): discordance between mitochondrial DNA and Y-chromosome phylogenies. Molecular Phylogenetic and Evolution. 40:739-749. Robert JA, Widjayanti S, Estuningsih E, Hetzel DJ. 1997. Evidence for major gen determining the resistance of indonesian thin tail sheep against Fasciola gigantica. Vet. Parasitol.68:309-314. Romjali E, Pandey VS, Barubara A, Gatenby RM, Verhulst A. 1996. Comparison of resistance of four genotype of rams to experimental infection with Haemoncul contortus. Vet. Parasitology. 65:127-137. Sumatri C, Einstiana A, Salamena JF and Inounu I. 2007. Performance and phylogenic relationship among local sheep in Indonesia by morphological analisis. JITV. 3(2):78-86. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Tapio M & Grigaliunaite I. 2002. Is there a role for mitocondria inheritance in sheep breeding?. Veterinarija Ir Zootechnika.T. 18(40):108-111. Utoyo Dp, Djarsanto, SN Nasution. 1996. Animal Genetic Resources and Domestic Animal Diversity in Indonesia. Ministry of Agriculture. Wu CH, Zhang YP, Bunch TD, Wang S, Wang W. 2003. Mitochondrial control region sequence variation within the argali wild sheep (Ovis ammon): evolution and conservation relevance. Mammalia. 67:109-118. Delvi Riana, Achmad Farajallah, dan Muladno. 2011. Diversitas Genetik Domba page 6 / 18
yang Tahan terhadap Infeksi Cacing Parasit berdasarkan mtdna Ruas Dloop dan Gen SRY. Kolokium disampaikan tanggal 10 Nopember 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB. PENDAHULUAN Latar Belakang Domba lokal Indonesia dikelompokkan dan dinamai berdasarkan morfologi dan daerah asalnya. Ada domba Madura, domba Indramayu, domba Sumbawa, domba Rote, domba kisar, dan domba Donggala (Sumantri et al. 2007); domba Jawa Ekor Tipis, domba Jawa Ekor Gemuk, dan domba Sumatra Ekor Tipis (Romjali et al. 1996; Robert et al. 1997); dan domba Garut (Priangan) (Mason et al. 1980). Tetapi domba lokal yang paling dikenal oleh masyarakat adalah domba Ekor Gemuk, domba Ekor Tipis dan domba Garut (Mason 1980; Utoyo et al. 1996; Mulliadi 1996). Domba merupakan hewan hasil domestikasi yang memiliki peran penting bagi kehidupan manusia. Daging dan susu domba dikonsumsi oleh manusia untuk memenuhi kebutuhan protein. Namun seiring dengan pengembangbiakannya domba mudah terinfeksi oleh cacing parasit. Cacing yang parasit pada hewan ternak dapat menyebabkan kerugian seperti penurunan berat badan, penurunan kualitas daging, kulit, dan jerohan, penurunan produktivitas ternak sebagai tenaga kerja pada ternak potong dan kerja, penurunan produksi susu pada ternak perah dan bahaya penularan pada manusia. Berdasarkan penelitian sebelumnya ada sampel domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit setelah diberi perlakuan dosis tertentu obat cacing dan beberapa sampel domba terinfeksi cacing tidak terpengaruh pemberian obat cacing. Dalam penelitian yang direncanakan ini, pengusul akan mengaplikasikan metode DNA Barcode berdasarkan gen DNA Mitokondria ruas Dloop untuk asal usul domba secara maternal dan XRY gen untuk asal usul domba secara paternal. DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). DNA mitokondria (mtdna) telah secara luas digunakan sebagai penanda evolusioner untuk studi Phylogeographic dan pola Phylogenetic (Tapio& Grigaliunaite 2002). Analisis sikuen MtDNA digunakan untuk studi taksonomi dengan ukuran sampel yang kecil karena bermutasi 5-10 kali lebih cepat dibandingkan DNA inti ( Wu et al. 2003). Kelebihan MtDNA antara lain bersifat page 7 / 18
haploid, tidak ada rekombinan, memiliki jumlah copi yang banyak, dan diturunkan secara maternal (maternal inherited) (Pidancier et al. 2006). MtDNA juga telah digunakan untuk menjelaskan kompleksitas dan asal usul berbagai ternak modern yang telah didomestikasi berdasarkan Maternal Lineages (Meadows et al. 2007). Ruas kontrol non coding Dloop pada mtdna merupakan ruas yang memiliki laju mutasi tinggi dibandingkan ruas gen mtdna yang lain. Ruas Dloop mengandung sekitar 300 bp. Perbedaan laju mutasi menyebabkan ruas Dloop lebih cocok sebagai penanda molekuler untuk intra spesies. Ruas yang banyak mengalami substitusi nukleotida kurang baik digunakan sebagai penanda molekuler antar spesies, sebab dapat meningkatkan nilai standar error (Firdhausi 2010). Penentuan jenis kelamin pada mamalia terkait dengan keberadaan kromosom Y yang mempunyai ruas gen dominan untuk pembentukan testis. Gen ini bertindak sebagai faktor penentu untuk pembeda jenis kelamin pada mamalia (Muttaqin 2010). Y kromosom berguna untuk studi filogeni yang diturunkan secara paternal ( paternal inherited) dan dengan pengecualian wilayah pseudoautosomal, tidak mengalami rekombinasi homolog pada meiosis (Pidancier et al 2006). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi filogeni dan diversitas genetik domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit berdasarkan mtdna ruas kontrol non coding D-Loop dan gen SRY. Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juni 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. BAHAN DAN METODE page 8 / 18
Sampel Darah Domba Darah dari 36 domba terdiri atas domba Ekor Tipis dan domba Ekor Gemuk yang berasal dari berbagai daerah di Pulau Jawa merupakan koleksi dari Prof. Muladno IPB. Sampel darah (whole blood) diambil sebanyak 1-1,5 ml disimpan dalam alkohol 70 % dengan volume minimum 2x volume sampel. Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel yang digunakan sebagai sumber DNA adalah dari sel darah (whole blood). Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal blood (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas non coding D-loop mtdna dan gen SRY akan dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang akan digunakan adalah primer spesifik yang mengenali ruas D-loop dan gen SRY sebagai DNA barcode pada mamalia ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik. Pengoptimasian akan dilakukan terhadap suhu penempelan dan berbagai konsentrasi pereaksi PCR. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing. page 9 / 18
Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilmaid dan berukuran sesuai desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genebank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data spesies domba yang terdapat pada Genebank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbor joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. RENCANA PENELITIAN DAFTAR PUSTAKA Firdhausi NF. 2010. Asal usul sapi madura berdasarkan penanda DNA mitokondria [tesis]. Bogor. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Mason IL. 1980. Prolific tropical sheep. FAO animal production and healt paper 17. FAO and UNEP 1980.Rome. Meadows JRS, Cemal I, Karaca O, Gootwine E, Kijas JW. 2007. Five ovine mitochondrial lineages identified from sheep breeds of the near east. Genetic. page 10 / 18
175:1371-1379. Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Mulliadi ND. 1996. Sifat fenotipik domba Priangan di Kabupaten Pandeglang dan Garut. [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Muttaqin WN. 2010. Philogeny and genetic diversity of indonesian local sheep based on mitochondrial DNA control region and SRY gene [tesis]. Bogor. Program Pacsasarjana, Institut Pertanian Bogor. Pidancier N, Jordan S, Luikart G, Taberlet P. 2006. Evolutionary history of the genus Capra (mammalia, artiodactyla): discordance between mitochondrial DNA and Y-chromosome phylogenies. Molecular Phylogenetic and Evolution. 40:739-749. Robert JA, Widjayanti S, Estuningsih E, Hetzel DJ. 1997. Evidence for major gen determining the resistance of indonesian thin tail sheep against Fasciola gigantica. Vet. Parasitol.68:309-314. Romjali E, Pandey VS, Barubara A, Gatenby RM, Verhulst A. 1996. Comparison of resistance of four genotype of rams to experimental infection with Haemoncul contortus. Vet. Parasitology. 65:127-137. Sumatri C, Einstiana A, Salamena JF and Inounu I. 2007. Performance and phylogenic relationship among local sheep in Indonesia by morphological analisis. JITV. 3(2):78-86. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics page 11 / 18
analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Tapio M & Grigaliunaite I. 2002. Is there a role for mitocondria inheritance in sheep breeding?. Veterinarija Ir Zootechnika.T. 18(40):108-111. Utoyo Dp, Djarsanto, SN Nasution. 1996. Animal Genetic Resources and Domestic Animal Diversity in Indonesia. Ministry of Agriculture. Wu CH, Zhang YP, Bunch TD, Wang S, Wang W. 2003. Mitochondrial control region sequence variation within the argali wild sheep (Ovis ammon): evolution and conservation relevance. Mammalia. 67:109-118. Delvi Riana, Achmad Farajallah, dan Muladno. 2011. Diversitas Genetik Domba yang Tahan terhadap Infeksi Cacing Parasit berdasarkan mtdna Ruas Dloop dan Gen SRY. Kolokium disampaikan tanggal 10 Nopember 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB. PENDAHULUAN Latar Belakang Domba lokal Indonesia dikelompokkan dan dinamai berdasarkan morfologi dan daerah asalnya. Ada domba Madura, domba Indramayu, domba Sumbawa, domba Rote, domba kisar, dan domba Donggala (Sumantri et al. 2007); domba Jawa Ekor Tipis, domba Jawa Ekor Gemuk, dan domba Sumatra Ekor Tipis (Romjali et al. 1996; Robert et al. 1997); dan domba Garut (Priangan) (Mason et al. 1980). Tetapi domba lokal yang paling dikenal oleh masyarakat adalah domba Ekor Gemuk, domba Ekor Tipis dan domba Garut (Mason 1980; Utoyo et al. 1996; Mulliadi 1996). Domba merupakan hewan hasil domestikasi yang memiliki peran penting bagi page 12 / 18
kehidupan manusia. Daging dan susu domba dikonsumsi oleh manusia untuk memenuhi kebutuhan protein. Namun seiring dengan pengembangbiakannya domba mudah terinfeksi oleh cacing parasit. Cacing yang parasit pada hewan ternak dapat menyebabkan kerugian seperti penurunan berat badan, penurunan kualitas daging, kulit, dan jerohan, penurunan produktivitas ternak sebagai tenaga kerja pada ternak potong dan kerja, penurunan produksi susu pada ternak perah dan bahaya penularan pada manusia. Berdasarkan penelitian sebelumnya ada sampel domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit setelah diberi perlakuan dosis tertentu obat cacing dan beberapa sampel domba terinfeksi cacing tidak terpengaruh pemberian obat cacing. Dalam penelitian yang direncanakan ini, pengusul akan mengaplikasikan metode DNA Barcode berdasarkan gen DNA Mitokondria ruas Dloop untuk asal usul domba secara maternal dan XRY gen untuk asal usul domba secara paternal. DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). DNA mitokondria (mtdna) telah secara luas digunakan sebagai penanda evolusioner untuk studi Phylogeographic dan pola Phylogenetic (Tapio& Grigaliunaite 2002). Analisis sikuen MtDNA digunakan untuk studi taksonomi dengan ukuran sampel yang kecil karena bermutasi 5-10 kali lebih cepat dibandingkan DNA inti ( Wu et al. 2003). Kelebihan MtDNA antara lain bersifat haploid, tidak ada rekombinan, memiliki jumlah copi yang banyak, dan diturunkan secara maternal (maternal inherited) (Pidancier et al. 2006). MtDNA juga telah digunakan untuk menjelaskan kompleksitas dan asal usul berbagai ternak modern yang telah didomestikasi berdasarkan Maternal Lineages (Meadows et al. 2007). Ruas kontrol non coding Dloop pada mtdna merupakan ruas yang memiliki laju mutasi tinggi dibandingkan ruas gen mtdna yang lain. Ruas Dloop mengandung sekitar 300 bp. Perbedaan laju mutasi menyebabkan ruas Dloop lebih cocok sebagai penanda molekuler untuk intra spesies. Ruas yang banyak mengalami substitusi nukleotida kurang baik digunakan sebagai penanda molekuler antar spesies, sebab dapat meningkatkan nilai standar error (Firdhausi 2010). Penentuan jenis kelamin pada mamalia terkait dengan keberadaan kromosom Y yang mempunyai ruas gen dominan untuk pembentukan testis. Gen ini bertindak sebagai faktor penentu untuk pembeda jenis kelamin pada mamalia (Muttaqin 2010). Y kromosom berguna untuk studi filogeni yang diturunkan secara paternal ( page 13 / 18
paternal inherited) dan dengan pengecualian wilayah pseudoautosomal, tidak mengalami rekombinasi homolog pada meiosis (Pidancier et al 2006). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi filogeni dan diversitas genetik domba yang tahan terhadap infeksi cacing parasit berdasarkan mtdna ruas kontrol non coding D-Loop dan gen SRY. Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juni 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. BAHAN DAN METODE Sampel Darah Domba Darah dari 36 domba terdiri atas domba Ekor Tipis dan domba Ekor Gemuk yang berasal dari berbagai daerah di Pulau Jawa merupakan koleksi dari Prof. Muladno IPB. Sampel darah (whole blood) diambil sebanyak 1-1,5 ml disimpan dalam alkohol 70 % dengan volume minimum 2x volume sampel. page 14 / 18
Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel yang digunakan sebagai sumber DNA adalah dari sel darah (whole blood). Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal blood (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas non coding D-loop mtdna dan gen SRY akan dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang akan digunakan adalah primer spesifik yang mengenali ruas D-loop dan gen SRY sebagai DNA barcode pada mamalia ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik. Pengoptimasian akan dilakukan terhadap suhu penempelan dan berbagai konsentrasi pereaksi PCR. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing. Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilmaid dan berukuran sesuai desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan page 15 / 18
nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genebank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data spesies domba yang terdapat pada Genebank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbor joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. RENCANA PENELITIAN DAFTAR PUSTAKA Firdhausi NF. 2010. Asal usul sapi madura berdasarkan penanda DNA mitokondria [tesis]. Bogor. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Mason IL. 1980. Prolific tropical sheep. FAO animal production and healt paper 17. FAO and UNEP 1980.Rome. Meadows JRS, Cemal I, Karaca O, Gootwine E, Kijas JW. 2007. Five ovine mitochondrial lineages identified from sheep breeds of the near east. Genetic. 175:1371-1379. page 16 / 18
Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Mulliadi ND. 1996. Sifat fenotipik domba Priangan di Kabupaten Pandeglang dan Garut. [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Muttaqin WN. 2010. Philogeny and genetic diversity of indonesian local sheep based on mitochondrial DNA control region and SRY gene [tesis]. Bogor. Program Pacsasarjana, Institut Pertanian Bogor. Pidancier N, Jordan S, Luikart G, Taberlet P. 2006. Evolutionary history of the genus Capra (mammalia, artiodactyla): discordance between mitochondrial DNA and Y-chromosome phylogenies. Molecular Phylogenetic and Evolution. 40:739-749. Robert JA, Widjayanti S, Estuningsih E, Hetzel DJ. 1997. Evidence for major gen determining the resistance of indonesian thin tail sheep against Fasciola gigantica. Vet. Parasitol.68:309-314. Romjali E, Pandey VS, Barubara A, Gatenby RM, Verhulst A. 1996. Comparison of resistance of four genotype of rams to experimental infection with Haemoncul contortus. Vet. Parasitology. 65:127-137. Sumatri C, Einstiana A, Salamena JF and Inounu I. 2007. Performance and phylogenic relationship among local sheep in Indonesia by morphological analisis. JITV. 3(2):78-86. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. page 17 / 18
Tapio M & Grigaliunaite I. 2002. Is there a role for mitocondria inheritance in sheep breeding?. Veterinarija Ir Zootechnika.T. 18(40):108-111. Utoyo Dp, Djarsanto, SN Nasution. 1996. Animal Genetic Resources and Domestic Animal Diversity in Indonesia. Ministry of Agriculture. Wu CH, Zhang YP, Bunch TD, Wang S, Wang W. 2003. Mitochondrial control region sequence variation within the argali wild sheep (Ovis ammon): evolution and conservation relevance. Mammalia. 67:109-118. page 18 / 18