86 Lampiran 1. Larutan yang digunakan pada medium RPMI 1640 RPMI 1640 medium 10,4 g Penisilin G 100.000 IU Streptomisin 100 mg Gentamisin 5 mg Kanamisin 250 µg Semua bahan tersebut dilarutkan kedalam 1000 ml akuades steril, ph 6,8. Larutan disaring dengan membran filter ukuran 0,45 µl. Lampiran 2. Larutan yang digunakan pada uji Bradford Coomassie brilliant blue G-250 100 mg Ethanol 95% 50 ml Asam fosfat 85% Bahan-bahan tersebut diencerkan dengan akuades sampai 1000 ml dan disaring dengan kertas saring.
87 Lampiran 3. Reagen SDS PAGE Phosphate buffered saline NaCl 8,0 g KCl Na 2 HPO 4 1,15 g KH 2 PO 4 Dilarutkan dalam 1000 ml akuadest. Autoclave pada tekanan 15 lbs selama 15 menit, ph akhir pada kisaran 7,2 7,4. Buffer reservoir Glisin 0,192 M 28,8 g Tris buffer 0,025 M 6 g 0,1% w/v sos Semua bahan dicampur, diukur sampai ph 8,3 dan ditambahkan 2 g SDS, volume akhir 2 liter, dan disaring. Buffer gel pemisah SDS 1 g Tris buffer 1,4 M 45,5 g HCl samapai ph 8,8 Akuades sampai volumenya menjadi 250 ml. Buffer gel pengumpul Tris buffer 1,4 M 15,1 g SDS 1 g Akuades sampai volumenya menjadi 250 ml, ph 6,8 dan disaring.
88 Buffer sampel Mercaptoethanol 2 ml Glycerol 4 ml Tris buffer 0,3 g Bromfenol blue 2 ml Semua bahan dicampur, dilarutkan ke dalam akuades kurang dari 20 ml, ph 6,8 dan ditambahkan dengan 0,92 g SDS mencapai volume 20 ml, disaring. Larutan pewarna Coomassie brilliant blue R 250 0,32 g Methanol 125 ml Asam asetat glasial 25 ml Akuades Coomassie blue dilarutkan dengan methanol, dan ditambahkan asam asetat glasial dalam akuades. Larutan pencuci Methanol Asam asetat Akuades Semua bahan dicampur. 800 ml
89 Lampiran 4. Larutan yang digunakan untuk FPLC 1. Elution buffer 20mM NaH 2 PO 4 2,75 g Dilarutkan dalam satu liter pada ph 7,5 2. Binding buffer, K 2 SO 4 (potasium sulfat) 0,5 M dalam 20 mm elution buffer K 2 SO 4 43,67 g Dilarutkan dalam 500 ml elution buffer pada ph 7,5 3. Clearing buffer (dipropanol 30%) Sebanyak 30 ml dipropanol dilarutkan dalam 70 ml elution buffer ph 7,5 4. Pelarut sampel Dilarutkan dalam elution buffer pada ph 7,5. Untuk melarutkan sampel, satu bagian pelarut sample dicampurkan dengan satu bagian sampel.
90 Lampiran 5. Larutan yang digunakan untuk Uji ELISA 1. Carbonate-bicarbonate buffer ph 9,6 (coating buffer) Sodium carbonate 1,59 g Sodium bicarbonate 2,93 g 1 liter Larutan dibuat pada ph 9,6 dengan penambahan NaCl atau NAOH 2. PBS-Tween 0,05% Sodium chloride Potasium cgloride Potasium phosphate (KH 2 PO 4 ) Sodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) Tween 20 8,0 g 1,15 g 0,5 ml 1 liter 3. Larutan substrat ABTS Stock ABTS 52 mm ABTS (Sigma) 0,286 g 10 ml Larutan disimpan di tempat gelap pada temperatur 4 o C Citrate buffer ph 4,2 (10 mm Na citrate ph 4,2) Larutan A Sodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) 14,2 g 500 ml Larutan B Citric acid 10,5 g 500 ml Larutan A (50 ml) dicampurkan dengan 55 ml larutan B
91 Substrat siap pakai Stock ABTS 200 µl Citrate buffer 10 ml 2 130 mm (33%) 3 µl Larutan tersebut dapat disimpan pada 4 o C untuk waktu lebih dari 12 bulan atau pada temperatur kamar untuk waktu satu bilan. Penambahan zinc metal pada 10 ml ABTS stock perlahan-lahan akan menghilangkan latar belakang warna hijau dari substrat tanpa mempengaruhi aktivitas substrat. 4. TBS-Tween casein 0,2% Tris-HCl NaCl Casein Tween 20 1,58 g 8,18 g 2 g 0,5 ml 1 liter
92 Lampiran 6. Pewarnaan Imunohistokimia Sampel yang terlebih dahulu telah diproses mulai dari sampling sampai dengan penyayatan dengan ketebalan 3-5 µm diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia. Tahapan pewarnaannya adalah sebagai berikut: Xylol III (3 menit) Xylol II (3 menit) Xylol I (5 menit) Alkohol absolut III (3 menit) Alkohol absolut II (3 menit) Alkohol absolut I (3 menit) Alkohol 95% (3 menit) Alkohol 90% (3 menit) Alkohol 80% (3 menit) Alkohol 70% (5 menit) Aquadest 5 menit Hangatkan dalam sitrat buffer (90-95 o C, 45 menit) Biarkan dalam sitrat buffer hangat (20 menit) Perendaman dalam 3% 2 (20 menit) Perendaman dalam 0,1% skim milk (30 menit) Aquadest 3x @5 menit Inkubasi dengan antibodi primer (50-60 µl ) refrigerator 4 o C overnight, pengenceran (dengan PBS 1000x). Pencucian dengan PBS 3x @5 menit Inkubasi dengan antibodi sekunder (rabbit anti-chicken IgY HRP conjugate), 60 menit, cuci dengan PBS 3x @5 menit Tambahkan 50 µl 2 Tetesi dengan AEC yang telah dibuat diatas, 1-2 menit Cek hasilnya, cuci dengan PBS 3x @5 menit, kemudian dengan aquadest 10 menit Counterstain, untuk pembedaan pewarnaan (Lillie Meyer Hematoksilin), Genangi dengan gliserin dan tutup dengan cover glass, cek di bawah mikroskop