LAMPIRAN. Lampiran 1 prosedur pewarnaan hematoksillin-eosin (HE)

Transkripsi

1 51 LAMPIRAN Lampiran 1 prosedur pewarnaan hematoksillin-eosin (HE) Pewarnaan HE adalah pewarnaan standar yang bertujuan untuk memberikan informasi mengenai struktur umum sel dan jaringan normal serta perubahan (kerusakan) umum yang disebabkan oleh penyakit. Adapun prosedur pewarnaan HE (Kiernan 1990) adalah: 1. Proses awal pewarnaan jaringan melakukan deparafinisasi yaitu slide preparat di rendam dalam xylol I,II,III masing-masing selama Proses rehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi 100% (alkohol absolut I, II, III), 95%, 90%, 80%, 70% masing-msing selama Slide preparat dibilas dengan air mengalir (air kran) selama menit dan selanjutnya dimasukkan dalam aquadest (DW) selama Preparat diwarnai dengan pewarna hematoksillin selama detik. 5. Preparat dibilas dengan air mengalir (air kran) selama 10 menit dan selanjutnya dimasukkan dalam aquadest (DW) selama 5 6. Preparat diwarnai dengan pewarna eosin selama Preparat didehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 95% dan 100% (alkohol absolut I, II, III) masing-masing selama Preparat dijernihkan (clearing) dengan xylol I, II, III masing-masing selama Proses terakhir adalah mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan gelas penutup (cover glass) dengan bahan perekat balsem anada atau Entellan. 10. Pengamatan di mikroskop. Hasil : inti berwarna biru keunguan (menyerap warna hematoksilin), sedangkan sitoplasma, jaringan ikat, keratin dan eritrosit berwarna merah (menyerap warna eosin).

2 52 Lampiran 2 prosedur pewarnaan imunohistokimia Pewarnaan imunohistokimia (IHK) adalah metode pewarnaan bahan aktif pada suatu jaringan. Prinsip dasar dari teknik Imunohistokimia adalah terjadinya interaksi antara Antibodi spesifik dengan epitop dari Antigen spesifiknya pada suatu jaringan, maka teknik IHK dapat digunakan untuk mendiagnosa suatu penyakit (sebagai antigen), bahkan boleh dikatakan bahwa IHK mempunyai spesifisitas yang tinggi sebagai alat diagnosa penyakit. Adapun prosedur pewarnaan IHK: 1. Proses awal pewarnaan jaringan melakukan deparafinisasi yaitu slide preparat di rendam dalam xylol I,II,III masing-masing selama Proses rehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi 100% (alkohol absolut I, II, III), 95%, 90%, 80%, 70% masing-msing selama Slide preparat dibilas dalam aquadest (DW) selama Preparat dibilas dalam Phosphat buffered saline (PBS) selama Preparat dipanaskan dalam citrat buffer (1,05 gram citric acid dalam 1 liter aquadest) dengan suhu o selama Kemudian preparat diinkubasi dalam citrat buffer pada suhu kamar selama Preparat dibilas dengan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 8. Preparat direndam dalam H 2 O 2 3% untuk memblok aktifitas endogenous selama 20 menit pada suhu kamar. 9. Preparat dibilas dengan PBST (phosphat buffered saline tween) sebanyak 3 kali, masing-masing selama Preparat direndam dalam skim milk 10% (0,1 gr dalam 100 ml PBS) atau 10% normal goat serum selama Preparat dibilas dengan PBST (phosphat buffered saline tween) sebanyak 3 kali, masing-masing selama Sayatan jaringan dilingkari dengan Dako Pen. 13. Preparat diinkubasi dengan antibodi primer (monoclonal/polyclonal antibody: AB I) selama 1-2 jam dalam suhu kamar atau overnight pada suhu 4 o (refrigerator). 14. Preparat dibilas dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing 3

3 Preparat diinkubasi dengan antibodi sekunder (AB II) selama Preparat dibilas dengan DW Preparat diwarnai dengan larutan kromogen DAB selama detik. 18. Dilakukan counterstaining dengan hematoksillin selama 5 10 detik. 19. Preparat didehidrasi dengan alkohol bertingkat, dimulai dari 70%, 80%, 90%, 95% dan alkohol absolut I, II, III masing-masing selama learing preparat dengan xylol I, II, III masing-masing selama Proses terakhir adalah mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan gelas penutup (cover glass) dengan bahan perekat balsem anada atau Entellan. 22. Pengamatan di mikroskop. Hasil : reaksi positif antara antigen-antibodi ditunjukkan dengan warna kecoklatan

4 54 Lampiran 3 Tabel sidik ragam pengaruh pemberian ekstrak tanaman obat terhadap jumlah antigen virus H5N1 Sumber Keragaman Derajat bebas Jumlah kuadrat Jumlah kuadrat tengah Fhitung Nilai p Perlakuan ** Kelompok ** Galat Total Hasil uji lanjut mengunakan Duncan General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: IHK NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 134 MSE= Number of Means ritical Range Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N Perlakuan A I-1 A B A kontrol positif B A B A I-2 B A B A II-2 B B II-3 B B II I-3

5 55 General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: IHK NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 134 MSE= Number of Means ritical Range Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N KLP A Paru-paru B Limpa B B Hati Bursa Usus Trakea Pankreas