III. METODE PEELITIA 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Serpong, Tangerang. Penelitian dilaksanakan selama 13 bulan, dari bulan Juni 2008 sampai Juni 2009. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: a. Pada ruang preparasi media, seperti: Gelas piala, labu ukur, tabung kultur, corong, timbangan analitik, sudip, microwave, ph meter, magnetic stirer, dispenser, mikropipet, pipet volumetrik, oven, lemari es, hot plate, dan autoklaf. b. Pada ruang isolasi dan penanaman, seperti: Laminar cabinet air flow, bunsen, gunting, pinset, dan pisau scalpel. c. Pada ruang inkubasi (thermostatik). Ruangan dengan suhu, cahaya dan kelembaban yang terkontrol. 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 2 macam yaitu : a. Bahan Tanaman Bahan tanaman yang digunakan adalah pucuk G. versteegii hasil sterilisasi biji yang diperoleh dari Mataram. b. Bahan Media Kultur Jaringan Bahan-bahan media kultur yang digunakan dalam pembuatan media adalah media dasar Murashige dan Skoog (MS), gula, agar-agar, zat pengatur tumbuh IBA, BAP dan kinetin.
12 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Sterilisasi Alat Alat-alat yang digunakan perlu disterilisasi terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci dengan menggunakan air bersih dan desinfektan, kemudian disterilkan ke dalam autoklaf pada suhu 121 0 C dengan tekanan 2 atm selama 30 menit. Sebelum melakukan penanaman alat-alat tanam (pinset, gunting, mata pisau scalpel) disterilisasi dengan cara dicelupkan ke dalam alkohol 96 % kemudian dibakar dengan api bunsen. 3.3.2 Sterilisasi Media Kultur Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 20 menit. Sebelum digunakan, media disimpan selama 2-3 hari untuk mengetahui perubahan atau kontaminasi yang terjadi. Media yang terkontaminasi atau tidak membeku sempurna tidak digunakan sebagai media kultur. 3.3.3 Sterilisasi Lingkungan Kerja Sterilisasi lingkungan kerja dilakukan terhadap ruangan kerja, terutama pada ruangan kultur (inisiasi) dan ruangan inkubasi (thermostatik). Sterilisasi ruangan thermostatik dilakukan selama dua minggu sekali dengan menggunakan formaldehida, sedangkan sterilisasi ruang kultur terutama pada laminar air flow cabinet menggunakan sinar ultra violet yang dilakukan seminggu sekali selama 12 jam. 3.3.4 Pembuatan Media 3.3.4.1 Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan yaitu larutan stok makro, stok mikro, stok Fe-EDTA, stok vitamin dan stok hormon (IBA, BAP dan kinetin). Pembuatan larutan stok bertujuan menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Komposisi larutan stok yang digunakan disajikan pada lampiran 2. Unsur hara yang telah ditimbang sesuai berat yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dengan aquades sebanyak 1 liter. Larutan stok kemudian disimpan di lemari es.
13 3.3.4.2 Pembuatan Media MS Media MS dibuat dengan metode pengenceran larutan stok. Pengambilan laruton stok untuk 1 liter media MS dapat dilihat pada lampiran 2. Untuk mendapatkan volume 1 liter yang tepat sebaiknya penambahan gula pasir sebanyak 30 g/l dilakukan sebelum pengenceran. Komposisi media yang sudah lengkap kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan air aquades hingga mencapai volume akhir 1 liter. 3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan Pembuatan media perlakuan dilakukan dengan menambahkan ZPT pada larutan media MS. Langkah awal dalam pembuatan media perlakuan adalah pembuatan media MS seperti langkah sebelumnya. Langkah yang berbeda adalah adanya penambahan ZPT sebelum diencerkan dengan air aquades hingga volume akhir 1 liter pada komposisi media yang sudah lengkap. ZPT yang digunakan adalah golongan auksin (IBA) dan sitokinin (BAP dan kinetin). ZPT tersebut diambil dari larutan stok hormon yang telah dibuat sebelumnya. ZPT Auksin dan sitokinin dikombinasikan sesuai dengan rancangan percobaan (tabel 1). Setelah larutan media MS ditambahkan ZPT, larutan tersebut kemudian diukur dengan menggunakan ph meter. ph media yang umumnya digunakan dalam kultur jaringan berkisar antara 5,6-5,8 dengan dilakukan penambahan HCl 0,1 bila larutan ph 5,8 dan penambahan aoh 0,1 bila larutan ph 5,6, kemudian larutan media ditambahkan agar-agar sebanyak 8 gr/l dan dimasak dalam microwave sampai mendidih. Larutan media yang telah mendidih dituang ke dalam botol kultur sebanyak 10 ml untuk setiap botol kultur, selanjutnya ditutup dan diberi label sesuai dengan perlakuan. Botol yang telah terisi media kemudian disterilkan ke dalam autoklaf pada tekanan 17,5 psi (1,21 bar) dan suhu 121 C, 10 atm selama 20 menit. Setelah itu diamkan di dalam autoklaf dan tunggu suhu turun sampai 80 0 C 3.3.5 Penanaman Eksplan yang digunakan berasal dari kultur in vitro tanaman penghasil gaharu (G. versteegii). Sebelum dilakukan sub kultur pada media multiplikasi
14 tunas, terlebih dahulu dilakukan sub kultur pada media MS 0 selama 4 minggu. Hal ini bertujuan untuk menetralkan pengaruh perlakuan pada tahap awal dan multiplikasi. Setelah itu eksplan ditanam pada media sesuai perlakuan multiplikasi tunas, masing-masing 1eksplan per tabung. Bahan tanaman yang digunakan untuk multiplikasi tunas adalah pucuk eksplan yang panjangnya 1,5 cm dengan meninggalkan 3 daun paling atas dan daun tersebut dipotong sedikit untuk membedakan daun yang lama dan daun yang baru muncul. Proses penanaman dilakukan dalam kondisi steril di dalam laminar air flow cabinet kemudian dilanjutkan dengan inkubasi di dalam ruangan thermostatik dengan suhu, kelembaban, serta cahaya yang terkontrol. 3.4 Pengamatan Parameter yang diamati meliputi parameter kuantitatif dan parameter kualitatif yang dilakukan pada setiap pengamatan. Adapun parameter kuantitatif meliputi: 1. Tinggi planlet Pengukuran dilakukan dengan cara mengukur dari pangkal batang sampai titik tumbuh tertinggi. 2. Jumlah ruas Pengukuran dilakukan dengan menghitung ruas tanaman. 3. Jumlah tunas baru Pengukuran dilakukan dengan menghitung pertambahan tunas atau anakan yang baru muncul (aksilar atau adventif). 4. Jumlah daun Daun yang dihitung adalah daun yang baru tumbuh. Parameter kualitatif diperoleh dengan mendeskripsikan kondisi tanaman pada parameter kuantitatif yang meliputi : 1. Perakaran (berakar/tidak) 2. Pengkalusan (berkalus/tidak) 3. Kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning dan kematian. Pengukuran dilakukan dari luar tabung kultur dengan menggunakan mistar, sedangkan eksplan yang diamati tetap di dalam tabung kultur. Pengamatan
15 dilakukan selama 8 minggu dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. 3.5 Analisis Data Perhitungan parameter kualitatif meliputi persentase kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning (pencoklatan) dan kematian pada eksplan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: % Tingkat kontaminasi = eksplan terkontaminasi X 100% % Tingkat pencoklatan = eksplan mengalami pencoklatan X 100% % Tingkat kematian = eksplan mengalami kematian X 100% % Tingkat keberhasilan = eksplan yang bertunas X 100% Keterangan : = jumlah total eksplan yang tersedia tiap perlakuan Rancangan percobaan yang digunakan dalam menganalisis hasil penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL Faktorial) dengan jumlah 17 perlakuan dengan masing-masing ulangan sebanyak 6 kali, sehingga total planlet yang diamati adalah sebanyak 102 satuan percobaan. Adapun faktor atau perlakuan yang digunakan adalah kombinasi IBA, BAP dan Kinetin dengan konsentrasi yang berbeda. Kombinasi perlakuan disajikan dalam bentuk tabel berikut ini: Tabel 1 Media perlakuan kombinasi BAP, IBA dan kinetin BAP (mg/l) (A) IBA (mg/l) (B) Kinetin (mg/l) (C) 0.00 (B1) 0.05 (B2) 0.10 (B2) 0.00 (C3) 0.20 (C1) 0.40 (C2) 0.00 (A1) A1B3 A1B1 A1B2 A1C3 A1C1 A1C2 0.10 (A2) A2B3 A2B1 A2B2 A2C3 A2C1 A2C2 0.20 (A3) A3B3 A3B1 A3B2 A3C3 A3C1 A3C2 Keterangan tabel : A1 = BAP 0.00 mg/l B1 = IBA 0.00 mg/l C1 = Kinetin 0.00 mg/l A2 = BAP 0.10 mg/l B2 = IBA 0.05 mg/l C2 = Kinetin 0.20 mg/l A3 = BAP 0.20 mg/l B3 = IBA 0.10 mg/l C3 = Kinetin 0.40 mg/l Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut : Yijk = + Ai + Sj + (AS)ij + ijk
16 Keterangan : Yijk = ilai respon tanaman terhadap perlakuan BAP ke-i, IBA ke-j dan ulangan ke-k. = ilai tengah populasi. Ai = Pengaruh perlakuan BAP ke-i. Sj = Pengaruh perlakuan IBA ke-j. (AS)ij = Pengaruh interaksi antara perlakuan BAP ke-i dan IBA ke-j. ijk = ilai galat percobaan pada perlakuan BAP ke-i, IBA ke-j, dan ulangan ke-k. Catatan : Pada perlakuan kombinasi BAP dengan kinetin maka faktor IBA diganti dengan kinetin Analisis data dilakukan dengan menggunakan Daftar Sidik Ragam. Hipotesis dalam uji F Ho = Perlakuan tidak berpengaruh terhadap pertambahan tinggi, jumlah ruas, jumlah tunas dan jumlah daun. Hi = Perlakuan berpengaruh terhadap pertambahan tinggi, jumlah ruas, jumlah tunas dan jumlah daun. Pengambilan keputusan uji F F hitung > F tabel maka tolak Ho F hitung < F tabel maka terima Ho Untuk mengetahui pengaruh yang diberikan pada percobaan tersebut, maka dilakukan uji F pada taraf 5 %. Apabila hasil sidik ragam memberikan hasil berpengaruh nyata maka dilakukan uji lanjutan wilayah Duncan untuk mengetahui beda antar perlakuan. Pengolahan data menggunakan perangkat lunak SAS (Statistical Analysis System) 6.12.