PEMBUATAN MEDIUM KULTUR JARINGAN- Oleh: Drs. Iman Budisantoso, MP** I. PENDAHULUAN Perbanyakan tanaman dengan sistem Kultur Jaringan dilaksanakan dalam suatu laboratorium yang aseptik, baik peralatan maupun bahan-bahannya. Peralatan sederhana yang masih sederhana dapat digunakan yaitu almari penabur (ent kas) buatan sendiri ataupun dengan peralatan laboratorium kultur jaringan khusus yang lebih canggih seperti Laminar Air Flow Cabinet. Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacammacam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selerao tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti (George Z. Shenington, 1984 dalam Indrianto, A,2002). Pada dasamya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk ssmua sel, penggantian medium atau salah satu komponen medium seringkali diperlakukan untuk merespon setiap type pertumbuhan dan satu macam eksplan. II. PEMBUATAN MEDIUM KULTT]R Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalkan, medium Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh Anggrek, tetapi tidak { cocok untuk media tumbuh tanaman yang lain. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya cocok untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek. Untuk membuat medium kultur jaringan, biasanya menimbang setiap : bahan kimia yang terdapat pada resep media dasar. Bahan kimia media seperti hara makro, sukrosa, agar-agar dapat ditimbang biasa, sementara untuk bahan media seperti *) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan @KFI) Desa Banteran Sumbang, pada Tanggal 1 Okt 2015.
hara mikro, besi, vitamin, hormon dan mio-inositol karena ukuran sangat kecil maka harus dilakukan dengan cara membuat larutan stok supaya takaran sesuai dengan resep yang ditentukan. Untuk pembuatan larutan stok harus cermat, jangan terlalu pekat karena dapat terjadi pengendapan bila disimpan dalam lemari S, bila terjadi pengendapan harus dipanaskan dulu sebelum digunakan dan bila terkontaminasi mikoorganisme tidak boleh digunakan lagi. 2.1. Carupembuatan larutan stok, media MS, stok hara mikro. Sebagai contoh akan diuraikan tentang cara pembuatan larutan stok mikronutrien pada medium MS. Mikronutrien yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, maka stok mikronutrien harus dibutat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Di bawah ini akan dibuat larutan stok (Ari Indrianto, 1990) dengan volume 500 ml (100 kali konsentrasi). Dalam contoh ini sengaja dibuat 100 kali konsentrasi. Tujuannya adalah supaya dalam penimbangan komponen bahan kimia tidak mengalami ksesulitan sebab berat bahan kimia tersebut sangat kecil (CoCl2.6H2O beratnya 0,025 mili gram). Apabila konsentrasi dikalikan 100 maka penimbangan menjadi 2,5 mili gram sehingga tidak telalu kecil dan tidak sulit untuk ditimbang. Langkah-langkah pembuatannya ialah sebagai berikut : (a) Menimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik masingmasing sebanyak: MnSOa.HzO ZnSOq.4HzO HrBO: KJ NaMoO+.2HzO CuSOa.SHzO 2.230,0 mg 860,0 mg 620,0 mg 83,0 mg 25,4 mg 2,5 mg CoClz.6HzO 2,5 mg (b) Bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala 500 ml yang berisi air suling sebanyak 300 ml. Setiap kali dimasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan (botol erlenmeyer digoyang-goyang pelan-pelan dengna arah memutar). Kemudian bahan-bahan berikutnya dimasukkan. Apabila semua bahan kimia *) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan @KH) Desa Banteran Sumbang pada Tanggal I Ok:t 2015.
dimasukkan secara bersamaan, dapat terjadi presipitat (endapan). Apabila bahan kimia tersebut adayang sukar dilarutkan, dapat menggunakan alat magnetic stirer. (c) Larutan yang sudah jadi kemudian ditambah air suling sampai volume menjadi 500 ml. (d) Botol-botol tersebut ditutup dengan rapat, kemudian diberi label : Mikronutrien 100 kali,5 mvl. (e) Untuk membuat 1 liter medium memerlukan 5 ml stok, dan untuk membuat 50 ml medium memerlukan 2,5 ml stok. Untuk larutan stok besi karena komponen Na2.EDTA dan FezSO+.7HzO sukar larut di dalam air suling, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl, dan kemudian dipanaskan. 2.2. Stok Zat Pengatur tumbuh Penentuan zat pengafiir tumbuh yang akan digunakan memerlukan pengetahuan tentang cara menghitung dosisnya. Hal ini sangat penting karena apabila perhitungannya keliru dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan. Seperti telah diuraikan di muka bahwa zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru akan mnghambat pertumbuhan kalus. Zat pengafix tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekaan 1-10 mg/ml. Menurut Indrianto (1990), cara membuat larutan stok IAA, NAA, 2,4-D sebanyak 100 ml dengan dosis 1000 ppm (1 mg/l ml) adalah sebagai berikut : (1) Bahan sebanyak 100 mg ditimbang dan setiap bahan dituangkan ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi air suling kira-kira 70 ml. (2) Sambil diaduk, diteteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai { larut benar (ernih). (3) Larutan dipindahkan dalam labu takar 100 ml dan ditambah air suling sampai volume menjadi 100 ml. (4) Memindahkan larutan ke dalam wadah stok, kemudian ditutup rapat-rapat, dan diberi label IAA (1 mg/ml), NAA (l mg/ml), 2,4'D (1 mg/ml), atai IBA (l mg/md. Selanjutnya disimpan dalam almari es. (5) Untuk membuat perlakuan auksin pada media I ml stok setara dengan I mg auksin. *) Disampaikan pada Kegiatan Prograrn Keluarga Harapan @KH) Desa Banteran Sumbang pada Tanggal I OL1 2015.
Sisa dari larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis 2 ppm sebanyak 500 ml, maka larutan stok yang akan kita ambil dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : VlMl : Vl = Ml = V2 : M2 = Vzlvlz volume larutan stok yang dicari (x) dosis larutan stok yang tersedia volume medium Yang akan dibuat dosis medium Yang akan dibuat Maka perhitungannya adalah sebagai berikut : VlMl = Vzlvl2 x.1000 = 500.2 x : l mvliter Berarti untuk membuat medium dengan volume 500 ml, kita mengambil larutan stok sebanvul ' 509 t 1= 0,5m1 " 1000 2.3. Carc Membuat Medium MS Komposisi hormon dalam media sangat bervariasi, tergantung dari spesies atau varietas tanaman yang dikembangbiakan, eksplan yang dipakai, dan tujuan dari kultur. Oleh karena itu, penambahan zat pengatur tumbuh tidak dapat diterapkan kadarnya.tidak dapat diterapkan kadarnya.ikut ini dijelaskan tahap-tahap pembuat medium yang diperjelas dengan skema pembuatan medium MS (Gambar- 20). *) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan (PKII) Desa Banteran Sumbang, pada Tanggal I Okt 20 I 5 '
Makro nutrien Sukrosa tlkurph 5.7-5. BilapH kurang tambah KOH Bila ph lebih tambah HCL Tambahkan aquades sampai volume menjadi 1000 ml Masukkan AGAR-AGAR, pan{nkan sampai larut sambil diaduk dengan pengaduk kaca Tuangkan larutan dalam erlenmeyer atau botol kultur Tutup botol dengan kapas dan alumunium foil, lalu STERILISASI Gambar 20. Skema pembuatan medium MS volume I liter *) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan (PKII) Desa Banteran Sumbang, pada Tanggal I Okt 2015.
2.4. Keterangan Gambar : 1. Menyiapkanalat-alat yang akan digunakan, yaitu : timbangan analitilq tabung erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, pipet, pengaduk kac4 stirer, kompor gas, kerta ph, botol medikum, aluminium foil, kapas (boleh tidak). 2. Bahan kimia makro nutrien dan setiap larutan stok sudah dipersiapkan dengan dosis l mfml. 3. Aquades sebanyak kurang lebih 300 ml dalam labu erlenmeyer dipersiapkan. 4. Menimbang komponen-komponen bahan kimia makro nutrien, kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer tadi satu per satu sambil digoyangkan secara memutar datar sehingga bahan kimia yang dituangkan sungguh-sungguh larut. 5. Mengambil larutan stok besi, mikro nutrien,vitamin dan hormon yang dosisnya 1000 ppm, sehingga untuk I liter medium harus diambil 10 ml larutan stok. Labu erlenmeyer digoyangkan. 6. Menimbang mio-inositol dan sukrosa, kemudian dimasukkan ke dalam labu satu per satu sambil digoyang-goyangkan sampai larut. 7. Aquades dituangkan sampai kurang lebih menjadi 900 ml(mendekati 1000 ml). 8. ph-nya diukur dengan menggunakan kertas ph, dan dilihat angkanya pada skala warna. Bila ph masih dibawah 5,7 maka perlu ditambah KOH 1-2 tetes, tetapi bila ph sampai mencapai 6,0 (melebihi 5,8) maka ditambah HCI 1 tetes. 9. Menuangkan aquades hingga volume mencapai 1000 ml. 10. Memasukkan agar-agar ke dalam labu. 11. Erlenmeyer dipanaskan di atas kompor gas sambil diaduk dengan pengaduk kaca Vmpai mendidih dan agarnya larut semua. 12. Dituang ke dalam botol medium kurang lebih 5-10 ml perbotol, tergantung besar kecilnya botol. 13. Botol medium ditutup dengan aluminium foil, dan diusahakan supaya benar-benar tertutup rcpat. 14. Memasukkan botol-botol medium tersebut ke dalam autoklaf dan disterilisasi dengan suhu 1200C, dan tekanan I,5 kglcm2 selama 15-20 menit. *) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan EKH) Desa Banteran Sumbang; pada Tanggal I Old 2015.
15. Botol-botol yang mediumnya sudah steril diangkat, kemudian disimpan di tempat yang sejuk sampai siap untuk penanaman eksplan. Daftar Pustaka Hendaryono, D.P.S. dan Ari Wijayani,l994 Teknik Kultur Jaringan. Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif - Modern, Penerbit Kanisius - Jakarta. *)DlsampaikanpadaKegiatanPro_grarnKeluargaHarapan@KrI)DesaBanteranSumbangpadaTanggal 1Ol11 2015.