Skrining Bkteri sm Lktt sl Susu Kmbing Pernkn Etw sebgi Penghsil Bkteriosin Indh Nur Fitri 1), Tri rdyti 2) 1),2) Jurusn Biologi, Fkults Mtemtik dn Ilmu Pengethun lm Universits Brwijy, Mlng, Indonesi 1) indhnfitri@gmil.om dn 2) tri_rdyti@yhoo.om BSTRK Bkteri sm lktt (BL) merupkn mikroorgnisme yng tergolong GRS (Generlly Reognized s Sfe). Sebgin besr BL memiliki potensi sebgi penghsil bkteriosin. Bkteriosin merupkn senyw protein yng disintesis oleh ribosom dn mmpu menghmbt pertumbuhn bkteri linny. Penelitin ini bertujun untuk memperoleh BL penghsil bkteriosin dn mempeljri dy hmbt bkteriosin terhdp Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium. Penelitin ini menggunkn Rnngn k Kelompok (RK) dengn tig kli ulngn. Thpn dilkukn dengn isolsi BL sl susu kmbing Pernkn Etw (PE) pd medi MRS ditmbh dengn CCO 3 1%, krkterissi isolt BL, deteksi penghmbtn kultur BL terhdp bkteri uji, uji ktivits penghmbtn bkteriosin (CFS) terhdp bkteri uji, uji sensitivits bkteriosin terhdp enzim proteolitik, sert identifiksi BL dengn menggunkn PI 50 CHL test kit. Du bels isolt diperoleh dri isolsi, nmun hny 6 isolt (SKE5, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, dn SKE11) didug mmpu menghsilkn bkteriosin. Bkteriosin yng diproduksi oleh keenm isolt tersebut dpt terdegrdsi oleh enzim Proteinse K (1 mg/ml). Isolt SKE9 teridentifiksi sebgi Ltobillus urvtus merupkn kndidt isolt BL terbik kren menghsilkn bkteriosin dn menghmbt pertumbuhn Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium dengn indeks penghmbtn msing-msing sebesr 2,94 ± 0,59 dn 2,89 ± 0,89. Kt kuni : Bkteri sm lktt, Bkteriosin, Susu kmbing Pernkn Etw BSTRCT Lti id bteri (LB) re miroorgnisms inlude in group of generlly reognized s sfe. Most of LB hve poteny s bterioin produers. Bterioin is ribosomlly synthesized protein ble to inhibit the growth of other bteri. The im of this reserh were to obtin lti id bteri isolted from rossbreed Etw (PE) got s milk ble to produe bterioin nd to study the effet of bterioins from LB ginst Stphyloous ureus nd Slmonell thypimurium. The steps of the reserh were isoltion of LB using MRS medium ontining 1% of CCO 3, hrteriztion of LB, detetion the inhibition tivity of ulture ginst pthogeni bteri, ssy of bterioin (CFS) ginst Stphyloous ureus nd Slmonell thypimurium, ssy of bterioin sensitivity to proteolyti enzyme, nd identifition of isolte using PI 50 CHL test kit. Totl of twelve isoltes were obtined, however only 6 isoltes (SKE5, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, SKE11) were ble to produe bterioin. ll of bterioin produed were degrded by proteolyti enzymes, proteinse K (1mg/ml). Isolte SKE9 ws identified s Ltobillus urvtus, the best ndidte of bterioin produer ginst Stphyloous ureus nd Slmonell thypimurium with inhibition index of 2.94 ± 0.59 dn 2.89 ± 0.89, respetively. Keyword: Bterioin, Crossbreed Etw got s milk, Lti id bteri PENDHULUN Susu kmbing PE merupkn jenis susu yng mengndung nutrisi lengkp sehingg merupkn medi pertumbuhn yng idel untuk mikroorgnisme [1]. Slh stu kelompok utm bkteri yng tumbuh pd susu dlh bkteri sm lktt (BL). Bkteri sm lktt merupkn mikroorgnisme yng tergolong sebgi Generlly Reognized s Sfe (GRS) Jurnl Biotropik Vol. 2 No. 3 2014 164
yng menghsilkn senyw ntimikrob ntr lin sm orgnik, disetil dn bkteriosin. Senyw ntimikrob yng dihsilkn oleh BL dpt menghmbt pertumbuhn bkteri pembusuk mknn dn bkteri ptogen [2]. Oleh kren itu, bkteri sm lktt telh bnyk digunkn untuk memperpnjng umur simpn (shelf life) sutu produk tu dijdikn sebgi lterntif pengwetn mknn [3]. Oleh kren itu bkteriosin sngt penting bgi pengembngn industri pngn. Sehingg diperlukn eksplorsi bkteri sm lktt yng mmpu menghsilkn bkteriosin. METODE PENELITIN Isolsi dn Krkterissi Bkteri sm Lktt sl susu kmbing PE. Susu kmbing PE diperoleh dri Bli Besr Inseminsi Butn (BBIB) Singosri. Sebnyk 25 ml smpel susu kmbing PE dimsukkn ke dlm 225 ml NCl 0,85 % untuk memperoleh seri pengenern 10-1. Pengenern bertingkt dilkukn hingg 10-6. Bkteri sm lktt diisolsi menggunkn medi de Mn, Rogos nd Shrpe gr (MRS) yng mengndung 1% CCO 3 dengn metode pour plte. Isolt BL yng tumbuh diirikn oleh dny zon bening dn dimurnikn hingg diperoleh koloni tunggl dn ditumbuhkn pd medi MRS gr miring sebgi stok [4]. Isolt BL dikrkterissi dengn pengmtn morfologi koloni, uji ktlse dn pewrnn Grm. Deteksi Penghmbtn Kultur BL terhdp Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium. Stu ose isolt BL yng berumur 24 jm diinokulsikn dlm 10 ml medi MRS broth diinkubsi pd suhu 37 C selm 24 jm. Bkteri Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium dikulturkn pd 20 ml medi NB (Nutrient Broth) dn diinkubsi pd suhu 37 C hingg menpi densits sel 10 6 CFU/ml. Pengujin dilkukn dengn menggunkn metode gr well diffusion. Msing-msing kultur bkteri uji diinokulsikn ser spred plte sebnyk 100 µl ke dlm wn petri yng mengndung medi N yng telh memdt dn dibirkn hingg mengering. Kultur isolt BL kemudin diinokulsikn ke dlm msing-msing sumurn sebnyk 40 µl [5]. Selnjutny dilkukn inkubsi pd suhu 37 ºC selm 24 jm. Pengujin Penghmbtn (CFS) Bkteriosin terhdp Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium. Persipn ell free superntnt (CFS) dilkukn dengn menumbuhkn isolt terpilih dlm 10 ml MRS broth dn diinkubsi pd suhu 37 C selm 24 jm. Sebnyk 5 ml dri hsil kultur tersebut diinokulsikn ke dlm 45 ml MRS broth dn diinkubsi pd suhu 37 C selm 24 jm. Kultur bkteri yng telh berumur 48 jm disentrifugsi pd suhu 4 C dengn keeptn 10.000 rpm, selm 15 menit. Superntn dimbil dn ditur phny dengn menggunkn NOH (1,0 M) menjdi ph 6,5. Superntn difiltrsi dengn menggunkn membrne filter steril yng berukurn 0,22 µm. Sebnyk 100 µl bkteri uji dengn densits 10 6 CFU/ml diinokulsikn ser spred plte ke dlm medi N yng telh memdt. Setelh hsil spred plte mengering, kultur isolt BL kemudin diinokulsikn ke dlm msing-msing sumurn sebnyk 50 µl [5]. Bikn kemudin diinkubsi pd suhu 37 ºC selm 24 jm. Sensitivits Bkteriosin terhdp Enzim Proteolitik. Lrutn Proteinse K dlm 20 mm Tris HCl ph 7 konsentrsi 1 mg/ml digunkn sebgi enzim proteolitik. Superntn bebs sel yng telh dinetrlkn dn difiltrsi kemudin dimpur dengn enzim Proteinse K dengn perbndingn 1:1 (v/v). Cmpurn diinkubsi pd 37 C selm 1 jm. Selnjutny dilkukn pemnsn pd suhu 100 ºC selm 5 menit. Pengujin dilkukn dengn metode gr-well diffusion terhdp bkteri uji. Kontrol berup superntn bebs sel yng tidk dilkukn penmbhn enzim proteolitik [6]. Identifiksi isolt BL dengn PI 50 CHL test kit. Sebnyk du ose isolt BL yng telh berumur 84 jm diinokulsikn ke dlm 5 ml qudes steril. Selnjutny suspense tersebut diinokulsikn sebnyk 2 ml ke dlm 5 ml qudes steril hingg kekeruhn menpi 2 MFrlnd. Sebnyk 4 ml lrutn pd Jurnl Biotropik Vol. 2 No. 3 2014 165
kekeruhn 2 MFrlnd diinokulsikn ke dlm mpul yng berisi medium PI 50 CHL dn dihomogensi. Isolt BL yng terdpt pd medium PI 50 CHL dimbil dengn mikropipet steril dn diinokulsikn ke dlm strip yng telh berisi medi krbohidrt kemudin ditutup dengn minerl oil sebnyk du tetes pd msing-msing strip. Selnjutny strip medi PI 50 CHL tersebut diinkubsi pd 37ºC selm 48 jm. Pengmtn dilkukn dengn mentt hsil uji positif tu negtif pd setip strip. Hsil positif ditndi dengn berubhny wrn regen menjdi berwrn kuning dn khusus untuk strip nomor 25 berwrn hitm. Hsil negtif ditndi dengn tidk dny perubhn wrn pd strip (wrn biru keungun). Hsil pengujin dinlisis dengn menggunkn PI Web Softwre [7]. HSIL DN PEMBHSN Sebnyk du bels isolt BL yitu SKE1, SKE2, SKE3, SKE4, SKE5, SKE6, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, SKE11, dn SKE12 diperoleh dri hsil isolsi. Isolt tersebut membentuk zon bening pd medi MRS gr yng mengndung CCO 3 1 %. Semu isolt BL yng diperoleh merupkn Grm positif dn ktlse negtif. Isolt SKE5 memiliki kemiripn dengn Genus Pedioous kren memiliki bentuk sel tetrd dn memiliki koloni bewrn putih [8]. dimeter zon bening (mm) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 B S. ureus S. thypimurium b Gmbr 1. Penghmbtn kultur BL sl susu kmbing PE terhdp Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium SKE1 SKE2 SKE5 SKE7 SKE8 SKE9 SKE10 SKE11 SKE12 jenis isolt B Tujuh isolt BL memiliki penghmbtn terhdp Stphyloous ureus dn delpn isolt dpt menhmbt pertumbuhn Slmonell thypimurium. Nili penghmbtn kultur BL terhdp bkteri uji tersebut tidk berbed nyt stu sm lin. Kemmpun ntimikrob isolt BL terhdp bkteri uji berbed-bed, dikrenkn msing-msing isolt BL menghsilkn metbolit yng berbedbed. Perbedn metbolit yng dihsilkn dipengruhi oleh tipe metbolisme BL [9]. Enm isolt, yitu SKE5, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, SKE11, dn SKE12 merupkn isolt terpilih kren kultur BL tersebut mmpu menghmbt kedu bkteri uji (Gmbr 1). Nili dimeter zon bening pd penghmbtn bkteriosin (CFS) tidk berbed nyt, nmun penghmbtn tertinggi oleh isolt SKE5 (14, 34 ± 2,18 mm) diikuti oleh isolt SKE9 dengn dimeter sebesr 13,55 ± 4,09 mm. Penghmbtn bkteriosin (CFS) terhdp Slmonell thypimurium terjdi hny pd empt isolt yitu SKE7, SKE8, SKE9, dn SKE10. Dimeter tertinggi oleh SKE8 (15,44 ± 1,85 mm) tidk berbed nyt dengn SKE9 dn SKE7 ser berturut-turut sebesr 11.66 ± 1.88 mm dn 12.77 ± 0.40 mm (Gmbr 3).. b Gmbr 2. Penghmbtn bkteriosin (CFS) isolt BL terhdp Stphyloous ureus ( dn b) dn Slmonell thypimurium ( dn d) Nili indeks penghmbtn bkteriosin (CFS) terhdp Slmonell thypimurium tertinggi dlh oleh SKE8 sebesr 3,21 ± 0,26 d Jurnl Biotropik Vol. 2 No. 3 2014 166
dn tidk berbed ser signifikn terhdp SKE7 dn SKE9. Nili indeks penghmbtn terhdp Stphyloous ureus oleh SKE5 dn SKE9 berturut-turut dlh sebesr 3,05 ± 0,31 dn 2,94 ± 0,59. Indeks penghmbtn BL terhdp Slmonell thypimurium tertinggi dlh oleh isolt SKE8 dn diikuti isolt SKE9 msing-msing sebesr 3,21 ± 0,26 dn 2,89 ± 0,89. Sebgin besr bkteriosin tidk mmpu menghmbt bkteri Grm negtif. Hl ini dikrenkn membrn sel bgin lur dri bkteri Grm negtif bertindk sebgi penghlng (brrier) meknisme ksi bkteriosin yng terjdi pd bgin membrn sitoplsm [10]. Beberp meknisme bkteriosin membunuh bkteri trget yitu dengn merusk dinding sel mikrob trget, destbilissi membrn sitoplsm, mengubh struktur sm nuklet, menghmbt kerj enzim, penghmbtn sintesis sm nuklet [11]. dimeter zon bening (mm) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 b jenis isolt Gmbr 3. Penghmbtn bkteriosin (CFS) isolt BL sl susu Kmbing PE terhdp Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium Pemberin Proteinse K pd CFS yng telh dinetrlkn mengkibtkn tidk terbentukny zon bening disekitr sumurn. Hl ini dikrenkn CFS mmpu terdegrdsi oleh enzim Proteinse K (1 mg/ml). Bkteriosin merupkn protein yng mmpu terdegrdsi oleh keberdn enzim proteolitik [12]. Dpt didug bhw semu isolt terpilih mmpu menghsilkn bkteriosin. Berdsrkn PI 50 CHL test kit, isolt SKE9 teridentifiksi sebgi Ltobillus urvtus spp uvtus dengn % ID sebesr 99,8 %. Ltobillus urvtus merupkn BL yng b S. ureus S. thypimurium SKE5 SKE7 SKE8 SKE9 SKE10 SKE11 b mmpu menghsilkn bkteriosin yitu urvtiin. Curvtiin dikethui memiliki spektrum ntimikrob terhdp beberp strin bkteri ntr lin Listeri monoytogenes, Stphyloous ureus, dn Enteroous felis [13]. Berdsrkn penelitin ini, dpt dikethui bhw urvtiin yng dihsilkn oleh Ltobillus urvtus mmpu menghmbt pertumbuhn bkteri ptogen yitu Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium. KESIMPULN Terdpt enm isolt BL sl susu kmbing PE yitu SKE5, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, SKE11 yng didug mmpu memproduksi bkteriosin. Isolt-isolt tersebut mmpu menghmbt pertumbuhn Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium, tetpi isolt SKE5 dn SKE11 hny mmpu menghmbt pertumbuhn Stphyloous ureus. Kndidt isolt terbik berdsrkn indeks penghmbtn penghsil bkteriosin dlh SKE9 dn SKE8. Isolt SKE9 telh teridentifiksi sebgi Ltobillus urvtus. Bkteri tersebut mmpu menghsilkn bkteriosin yng menghmbt pertumbuhn Stphyloous ureus dn Slmonell thypimurium dengn indeks penghmbtn ukup tinggi msing-msing sebesr 2,94 ± 0,59 dn 2,89 ± 0,89. UCPN TERIM KSIH Terim ksih dismpikn kepd Ibu Dr. Tri rdyti, M.gr., Ph.D., Dr. Suhrjono, M.Si. dn Dr. Ir. Nur Hidyt, MP yng telh bnyk membntu dlm proses penyelesin penelitin ini DFTR PUSTK [1] Henlein, G. 2004. Got Milk In Humn Nutrition. Smll Ruminnt Res 51(2):155 163. [2] Gonzles, B., r P., Myo B., dn Surez, J. 1996. Detetion, purifition, nd prtil hrteriztion of plntriin C, bterioin produed by Ltobillus plntrumm strin of diry origin. pplied nd Environmentl Mirobiology. 6:2158-2163. Jurnl Biotropik Vol. 2 No. 3 2014 167
[3] Nvro, L., Zrxg M., Senz J., Ruiz- Lrre F. dn Torres C. 2000. Bterioin Prodution by Lti id Bteri Isolted From Rioj Red Wines. Journl of pplied Mirobiology. 88:44-51. [4] Sujy I. N., mhi S., Yokot., son., dn Tomit F. 2000. Isoltion nd hrteriztion of lti id bteri in rgi tpe. World Journl of Mirobiology Biotehnology. 17: 349-357. [5] Yng, E., Lihu F., Yueming J., Crig D. dn Sherry F. 2012. ntimirobil tivity of bterioin-produing lti id bteri isolted from heeses nd yogurts. MB Express. Environmentl Mirobiology 69: 1797-1799 [12] Ttsdjieu, N.L., Njintng N.Y., Kemgng S. T., Doudou B., dn Mbofung C.M.F. 2009. Chrteriztion of lti id bteri produing bterioins ginst hiken Slmonell enteri nd Esherihi oli. frin Journl of Mirobiology Reserh. 3(5): 220-227. [13] Bouttefroy,., Linder M. dn MillieÁre J.B. 2000. Preditive models of the ombined effets of urvtiin 13, NCl nd ph on the behviour of Listeri monoytogenes TCC 15313 in broth. Journl of pplied Mirobiology. 88:919-929. [6] El-Shouny, W.. 2006. Chrteriztion of bterioin from Pseudomons eruginos. El -Mini Siene bull. 17(2): 279-304. [7] Cppuino, J. G. 1983. Mirobiology: Lbortory Mnul. ddison-wesley: US. [8] xelsson, L. 2004. Lti id Bteri: Clssifition nd physiology. In: Slminen, S., Wright,.V., Ouwehnd,., editors. Lti id Bteri. Mrel Dekker, In. New York. [9] Chrlier, C., Cretenet M., Even S., Le Loir Y. 2009. Intertions between Stphyloous ureus nd lti id bteri: n old story with new perspetives. Interntionl Journl of Food Mirobiology 131:30 39 [10] Retz, C.R.H. dn Whitfield C. 2002. Lipopolyshride endotoxins. nnul Review of Biohemistry 71: 635 700. [11] Luders T., Birkemo G.., Fimlnd G., Nissen-Meyer J., Nes I.F. 2002. Strong synergy between eukryoti ntimirobil peptide nd bterioins from lti id bteri. pplied nd Jurnl Biotropik Vol. 2 No. 3 2014 168