BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan selama 2 bulan pada bulan Maret sampai dengan Juni 2013 yang bertempat di Laboraturium Bioteknologi FPIK UNPAD kampus Jatinangor. 3.2 Alat Dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan selama penelitian adalah sebagai berikut: a. pengambilan sampel cawan petri gunting pinset timbangan analitik kamera cool box plastik bening b. isolasi DNA autoclave mikrotube Rak mikrotube Penggerus Centrifuge Water bath Mikropipet dan mikrotips Vortex-mixer Kulkas Timer 18

19 Timbangan analitik Gelas ukur c. Amplifikasi DNA Mesin Thermal cycler Microtube d. Elektroforesis Cetakan agarose magnetic stirrer alat elektroforesis power supply Ultraviolet illuminator Sendok pipih Kamera digital Computer Freezer -20 o C 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian diantaranya yaitu ikan lele sebagai objek penelitian, bahan-bahan kimia, seperangkat bahan amplifikasi DNA dan elektroforesis. a. Ikan uji Ikan uji yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ikan Sangkuriang, Dumbo, Albino, serta lele Lokal. Ikan objek diperoleh dari pembudidaya lele kolam tanah dilokasi yang ditentukan. Pada masing-masing sampel diambil bagian sirip sebagai sumber pembawa DNA. b. Bahan kimia yang digunakan dalam pengambilan sampel Ethanol : gliserol (4:1) Akuades Ethanol 70% Es curai

20 c. Isolasi DNA Es curai Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega) Ethanol 70% Isopropanol d. Amplifikasi DNA GoTaq master mix 2G fast Primer RAPD OPA 3, OPA 06, OPA 07, OPA 09, OPA 11, OPA 14, OPA 17, OPA 20 DNA template Nuklease free water (NFW) e. Elektroforesis Gel Agarose Loading dye larutan tris borate EDTA (TBE) Ethidium Bromide (EtBr) Marker Ladder 1kb Akuades Buffer pemuat (loading buffer) 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah bagian sirip ekor lele Sangkuriang, Dumbo, Albino, dan Lokal. Dipilihnya sirip ekor dengan pertimbangan tidak akan menyebabkan ikan mati. Pengambilan sampel dilakukan satu kali. Namun, dapat diulang apabila tidak mendapatkan hasil yang memadai Lele Sangkuriang, Dumbo, Albino, dan Lokal didapat dari pembudidaya dimana ikan itu berasal dan dilakukan pendataan tentang latar belakang ikan yang akan diuji seperti asal indukan, lokasi lingkungan budidaya, umur, jenis, dan latar belakang lainya yang akan mempengaruhi variasi genetik. Pengambilan isolat

21 DNA dan analisis data dilakukan di Laboratorium Bioteknologi FPIK UNPAD Jatinangor. Mempersiapkan ikan lele yang akan dianalisis wawancara pada pembudidaya tentang sejarah dan data parental ikan yang akan diuji Menggunting jaringan sirip ekor secukupnya menggunakan gunting yang sudah disterilisasi Gambar 3.1 Bagan Pengambilan Sampel Ada beberapa lokasi pengambilan ikan uji yang ditentukan (Lampiran 1). Di sumedang, ikan uji yang di ambil adalah lele Sangkuriang. Lele Sangkuriang berasal dari pembudidaya di daerah desa Baginda, alun-alun Sumedang. Dibudidayakan di kolam tanah yang pinggiran kolamnya sudah ditembok (kolam budidaya semi intensif), dengan umur ikan lele jantan dan betina sekitar 9 bulan serta merupakan calon indukan yang akan digunakan untuk budidaya selanjutnya. Indukan semula lele ini berasal dari Cijengkol. Di daerah Garut ikan uji yang diambil lele jenis Sangkuriang. Lele Sangkuriang ini merupakan keturunan atau hasil budidaya komersial di daerah limbangan kota Garut. Indukan dari ikan uji ini merupakan yang ke-2 dari indukan semulanya yang berasal dari Subang. Dibesarkan dikolam semi intensif dan merupakan indukan yang masih cukup produktif. umur dari ikan uji sekitar 3 bulan. Memasukan jaringan sirip ekor ke dalam Eppendorf 1,5ml Lele Lokal betina berasal dari sungai di daerah Kawali, Ciamis asalnya kurang diketahui. Lele Lokal betina ini bercorak putih hitam dan berukuran 25cm.

22 Sedangkan Lele Lokal jantan berasal dari Jakarta daerah Cilangkap. Lele Lokal ini sudah kurang diminati dipasar karena tingkat pertumbuhanya yang lambat sehingga menyebabkan semakin tergeser oleh ikan lele hasil introduksi yang memiliki gen pertumbuhan yang relatif lebih cepat. Lele Sangkuriang Tasikmalaya yang diujikan merupakan ukuran konsumsi yang berumur sekitar 3 bulan yang dibesarkan di kolam semi intensif dengan pakan berupa pelet dan pakan alternatif limbah ikan tongkol. Ikan uji ini berasal dari indukan keturunan pertama dari indukan asalnya yang dibawa dari Balai budidaya air tawar (BBAT) Cijengkol Subang pada tahun 2010. Lele Albino masih dari 1 lokasi dengan lele Sangkuriang Tasikmalaya. Berasal dari indukan lele dengan gen pigmentasi Albino dan dipertahankan dengan mempasangkan lele Albino ini dengan Albino lainya dari indukan berbeda untuk memperbesar jumlah keturunan Albino. Sampel yang diambil berumur 6 bulan dan belum pernah dipijahkan. Lele Dumbo didapat dari Singaparna ini berumur lebih dari 1 tahun dan merupakan indukan yang sudah tidak lagi digunakan oleh petani karena dinilai kurang produktif dan permintaan pasar yang sedikit untuk lele Dumbo dibanding dengan lele Sangkuriang. Lele Dumbo merupakan ikan hibrida antara Clarias gariepinus dan dengan Clarias fuscus (Rustidja 1999). Lele Dumbo uji ini dipelihara di dalam kolam semi intensif dengan pemberian pakan yang tidak teratur sehingga kemungkinan besar feeding habit lele ini dengan memangsa ikanikan kecil dan makhluk hidup lainya. 3.3.2 Isolasi DNA Isolasi DNA memiliki Prinsip memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. DNA diambil dari sirip ekor ikan lele. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan organelorganel sel, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 65 o C untuk menginaktifasi enzim yang

23 mendegradasi DNA (DNAase). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Tahapan-tahapan isolasi DNA ikan lele Sangkuriang, Dumbo, Albino, dan Lokal menggunakan Wizard Genomic purification Kit (Promega). Wizard Genomic Purification Kit (Promega) adalah kit pabrikan dibuat untuk mengisolasi DNA dari sel darah putih, jaringan sel hasil kultur dan hewan, jaringan tumbuhan, ragi, bakteri positif dan bakteri negatif. Langkah pertama dalam isolasi DNA adalah pengambilan jaringan sirip ekor pada ikan lele. Sirip ekor diambil dengan menggunakan gunting sebanyak +/- 10mg dan dihaluskan sampai dengan halus dalam tabung Eppendorf 1,5ml yang berisi Nuclei Lysis Solution dingin sebanyak 300µl. tahap berikutnya menginkubasi dalam water bath bersuhu 65 o C selama 15 menit. Masukan 1,5µl RNAse Solution lalu campurkan dan di inkubasi kembali di suhu 37 o C selama 20 menit dan tiriskan. Tambah 100µl Protein Precipitation Solution. Kemudian larutan di vorteks dan di dinginkan di dalam es selama 5 menit. Sentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. pindahkan supernatan ke tabung Eppendorf baru yang berisi 300µl isopropanol dengan suhu ruang lalu putar balik perlahan tabung Eppendorf. Sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 13.000rpm. buang supernatan, campurkan 300µl suhu ruang ethanol 70%. Kembali sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Buang ethanol, keringkan selama 15 menit. Rehidrasi DNA dengan 50µl Rehydration Solution selama 1 jam dalam water bath dalam suhu 65 o C (Lampiran 2). 3.3.3 Amplifikasi DNA dengan teknik RAPD-PCR Penelitian ini menggunakan delapan macam arbitrary primer berukuran 10 nukleotida yang diproduksi oleh Operon Technology untuk proses amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR. Kedelapan macam primer tersebut adalah RAPD OPA-03, OPA-06, OPA-07, OPA-09, OPA-11, OPA-14, OPA-17, dan OPA-20 yang sudah diseleksi untuk menghasilkan fragmen pada gel agarose (Danish, 2012). Setiap sampel yang didapatkan direaksikan dengan GoTaq master mix 2G fast 2X (Promega) 25µmol primer RAPD (10 bp), 10µg DNA

24 sampel sebagai template dan nuclease free water steril dengan volume total 25µl. Seluruh bahan dimasukan kedalam tabung micro tube steril berukuran 200 µl khusus untuk alat Thermal Cycler. Daftar primer RAPD dengan urutan basa dan komponen reaksi PCR dapat dilihat pada tabel 3.1. Tabel 3.1. Daftar primer RAPD dengan urutan basa Nama Primer Urutan Basa OPA 03 OPA 06 OPA 07 OPA 09 OPA 11 OPA 14 OPA 17 OPA 20 AGT CAG CCAC GGT CCC TGAC GAA ACG GGTG GGG TAA CGCC CAA TCG CCGT TCT GTG CTGG GAC CGC TTGT GTT GCG ATCC Penggunaan primer yang tepat untuk setiap jenis ikan uji diperlukan pengerjaan optimasi primer di atas. Primer hasil optimasi merupakan primer yang terbaik digunakan untuk setiap DNA template dan dipergunakan untuk menentukan adanya polimorfisme pada jenis lele uji. Reaksi penggandaan fragmen polimorfisme, dilakukan dengan mencampurkan komponen PCR dalam Tabel 3.2 dengan total reaksi PCR 25 µl. Tabel 3.2. Komponen Reaksi PCR Komponen PCR Konsentrasi 1 reaksi Volume GoTaq master mix 2G fast 2X 12,5 Primer RAPD 25pmol 1,0 DNA template 5µg/µl 2,0 Ditambahkan sampai - Nuclease Free Water 25µl

25 Tahap selanjutnya adalah formulasi campuran reaksi PCR dengan primer RAPD pada Tabel 3.2 dimasukan dalam thermal cycler, yaitu suatu alat untuk menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat. Reaksi ini bertujuan untuk mengamplifikasi (mereplikasi) pita pita DNA (amplikon) urutan basa khusus. Amplifaksi ini meliputi 3 tahapan besar, yakni tahap denaturasi DNA 95 o C selama 1 menit, tahap penempelan (annealing) 36 o C selama 1 menit, dan tahap pemanjangan (ekstensi) 74 o C selama 2 menit, saat annealing, homologi sekuens antara primer dan utas DNA turut berperan menentukan keberhasilan reaksi. Penggandaan fragmen DNA yang terkopi oleh primer RAPD dilakukan dengan 3 tahap di atas sebanyak 45 siklus. Fragmen yang dikenali oleh primer merupakan sekuen yang komplementer dengan sekuen primer tersebar di sepanjang genom dan mencerminkan polimorfik yang berkaitan dengan diversitas genetik suatu galur. Setting program ini disajikan pada tabel 3.3. Tabel 3.3. Setting program PCR No Proses Suhu o C Waktu (menit) Keterangan 1 pre denaturasi 95 2 1 Siklus 2 denaturasi 95 1 3 annealing 36 1 4 ekstensi 74 2 45 siklus 5 Final ekstensi 74 5 1 siklus Proses amplifikasi DNA ikan lele dimulai dengan menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Tahap pertama mengambil sampel DNA template masing-masing sampel. Menambahkan GoTaq master mix 2G fast sebanyak 12,5 µl, primer OPA-03, OPA-06, OPA-07, OPA-09, OPA-11, OPA-14, OPA-17, dan OPA-20 sebanyak 1µl, DNA template 2 µl dan NFW 9,5 µl. GoTaq master mix 2G fast merupakan cairan siap pakai berisi bakteri Taq DNA polimerase, dntps, MgCl 2 dan buffer reaksi pada konsentrasi optimal untuk amplifikasi DNA template pada PCR yang efisien. Penambahan primer dilakukan 1 primer untuk

26 seluruh sampel, sehingga akan diperoleh 96 sampel dari 12 DNA template dan 8 primer RAPD. Tahap berikutnya mengatur suhu dan waktu pada mesin PCR atau thermal cycler. Memasukkan sampel yang sudah siap untuk diamplifikasi berdasarkan kelompok primer yang ditambahkan pada masing-masing sampel. Menjalankan mesin PCR yang sudah diatur waktu dan suhu yang digunakan. Bagan alur kerja dapat dilihat pada lampiran 3. 3.3.4 Elektroforesis Sampel DNA yang telah diamplifikasi divisualisasi dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose. Gel agarose berkonsentrasi 1,4% diperoleh dengan mencampurkan bubuk agarose dan larutan TBE 0,5X (Tris- Borate EDTA). Tris Borate EDTA adalah cairan buffer yang didalamnya terdapat Tris base, asam boric, dan EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid). Gel agarose direndam secara sub marine dalam running buffer yaitu TBE 0,5X. 5µl DNA hasil PCR yang dimasukan ke dalam sumur-sumur gel. Beda potensial yang digunakan pada proses elektroforesis adalah 75 volt, dengan kuat arus 500mA selama 70 menit. Tahap pertama dalam proses elektroforesis adalah pembuatan gel agarose dengan konsentrasi 1,4% (Lampiran 4). Pembuatan gel agarose 1,4% dimulai dengan menimbang bubuk agarose sebanyak 0,56g, bubuk agarose dimasukan dalam Erlenmeyer dan menambahkan TBE sebanyak 40ml. tahap selanjutnya memanaskan larutan hingga mendidih dengan menggunakan Hot Plate Magnetic Stirrer. Setelah terlihat bening larutan agarose, pemanasan dihentikan dan didinginkan untuk menurunkan suhu larutan. Menyiapkan cetakan gel agarose lengkap dengan sisir untuk mencetak sumursumur pada gel agarose. Menuangkan larutan agarose pada cetakan, diamkan hingga membentuk gel agarose. Pada cetakan agarose telah terdapat sumur-sumur yang dipersiapkan untuk menyimpan sampel DNA hasil amplifikasi. Gel agarose yang sudah dingin dan berubah menjadi gel dipindahkan pada wadah elektroforesis dan menambahkan TBE sebagai buffer hingga merendam gel agarose. Mengambil DNA hasil amplifikasi menggunakan micropipete sebanyak 5µl. Memasukan DNA hasil

27 amplifikasi kedalam sumur-sumur pada gel agarose yang sudah disediakan. Setelah seluruh sampel masuk ke dalam sumur-sumur mulai running elektroforesis menggunakan tegangan sebesar 75 volt 500mA selama 70 menit. Bagan alur kerja elektroforesis terdapat pada lampiran 5. Hasil elektroforesis dari primer uji yang dapat mengamplifikasi setiap sampel yang diujikan akan dilakukan analisis lebih lanjut berupa pengolahan data menggunakan beberapa software-pc. 3.4 Analisis Data Pita-pita yang timbul pada agarose merupakan representasi dari fragmen DNA yang teramplifikasi. Setiap pita yang terbentuk pada agarose mempunyai panjang DNA yang berbeda. Panjang urutan basa DNA dapat diketahui dengan membandingkan jarak migrasi DNA yang standar digunakan. Grafik log panjang basa standar DNA terhadap jarak migrasi, menghasilkan presamaan. Persamaan selanjutnya digunakan untuk menjadi acuan dasar menentukan panjang fragmen DNA pada setiap pita yang timbul (Lampiran 6,7 dan 8). Data kualitatif didapatkan dari pita-pita yang tervisualisasi dan tidak tervisualisasi. Pita yang terlihat memiliki arti numerik satu (1) dan pita yang tidak terlihat memiliki arti numeric nol (0). Pita yang dapat dianalisis merupakan pita yang dapat dibedakan secara nyata dengan menggunakan bantuan computer. Pitapita tersebut ditampilkan dalam matriks biner dan selanjutnya akan dianalisis untuk mencari hubungan kekerabatan sampel ikan lele. Hubungan kekerabatan dapat diketahui dengan menghitung indeks kesamaan berdasarkan data numeric pita yang teramplifikasi. Perhitungan indeks kesamaan menggunakan program NTYSY pc pada computer. Hasil yang diperoleh berupa diagram pohon kekerabatan (filogeni) dan akan dibandingkan dengan ciri fenotip dari lele yang diujikan.