Lampiran 1. Foto lokasi Pengambilan Ikan Uji. Lele Sangkuriang Tasikmalaya. Lele Sangkuriang. Lele Dumbo Singaparna Lele Albino Lele Sangkuriang Garut

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 54 Lampiran 1. Foto lokasi Pengambilan Ikan Uji Lele Sangkuriang Sumedang Lele Lokal Lele Sangkuriang Tasikmalaya Lele Dumbo Singaparna Lele Albino Lele Sangkuriang Garut

3 55 Lampiran 2. Bagan Alur Kerja Isolasi DNA gerus 10mg sirip dalam 300µl Nuclei Lysis Solution dalam es curai inkubasi 65 o C selama 15 menit masukan 1,5 µl RNAse solution lalu campur, inkubasi di suhu 37 o C selama 20 menit Tambahkan 100µl Protein Precipitation Solution. Vorteks dan dinginkan dalam es selama 5 menit Sentrifugasi rpm selama 4 menit pindahkan supernatan ke tube baru berisi 300µl isopropanol suhu ruang putar balik tube perlahan sentrifugasi di rpm selama 1 menit buang supernatan, tambahkan 300µl suhu ruang ethanol 70%, campur sentrifugasi rpm selama 1 menit buang ethanol, keringkan selama 15 menit rehidrasi DNA dengan 50µl DNA Rehydration Solution selama 1 jam dalam suhu 65 oc simpan hasil isolasi di suhu -20 o C

4 56 Lampiran 3. Bagan Alur Kerja Amplifikasi DNA mengambil DNA template (DNA sampel) masing-masing sebanyak 2µl Menambahkan 1µl Primer RAPD, 12,5µl GoTaq master mix 2G fast, dan 9,5µl NFW seluruh sampel diamplifikasi dengan menggunakan thermal cycler yang disetting suhu dan waktunya menyimpan sampel yang telah diamplifikasi pada suhu -20oC Elektroforesis sampel hasil amplifikasi Proses Analisis hasil amplifikasi DNA

5 57 Lampiran 4. Bagan Alur Kerja Pembuatan Gel Agarose 1,4% menimbang bubuk agarose sebanyak 0,56gr Menambahkan TBE 0,5X sebanyak 40ml panaskan hingga mendidih menggunakan hot plate magnetic stirrer Mencetak gel agarose dalam cetakan agarose

6 58 Lampiran 5. Bagan Alur Kerja Elektroforesis Gel agarose 1,4% direndam dalam running buffer (TBE) secara sub marine Mencampurkan 2µl loading dye dengan 2µl marker 1kb (untuk marker) memasukan hasil campuran marker (4µl) dan DNA hasil PCR (5µl) pada sumursumur agarose yang sudah tersedia dengan menggunakan mikropipet running elektroforesis dengan menggunakan voltase 75 volt dan kuat arus 500mA selama 70 menit

7 59 Lampiran 6. Perhitungan Ukuran Larik DNA Hasil Amplifikasi a) Mengukur jarak migrasi DNA standar yang dimulai dari sumur gel sampai posisi larik DNA tersebut. Untuk mengukur jarak migrasi DNA dilakukan dengan menggunakan bantuan dari software CorelDRAW X5 agar ukuran larik DNA dapat dianalisis secara spesifik dan teliti. Ukuran jarak yang digunakan pada saat analisis menggunakan satuan millimeter. Nilai jarak dijadikan sumbu X. b) Analisis dilakukan mulai dari jarak sumur gel ke bawah pada ukuran fragmen DNA standar (Penanda genetik atau Lambda marker/pcr marker). c) Ukuran fragmentasi DNA standar dibuat nilai logaritma yang kemudian dijadikan sumbu Y. d) Membuat persamaan garis linier y = ax+b dari jarak migrasi DNA standar dan log pb pada PCR marker. e) Ukuran larik DNA hasil amplifikasi (dalam pb) dicari dengan memasukkan nilai jarak migrasi DNA tersebut (sebagai nilai x). f) Hasil dari nilai y yang didapat kemudian diubah menjadi antilog, hasil dari antilog menunjukkan ukuran basa dari larik tersebut.

8 60 Lampiran 7. Panjang fragmen DNA primer OPA-03 6,00 4,00 2,00 0,00 Jarak fragmen (mm) Log bp Antilog (INV- LOG) (bp) 36,405 4, ,228 3, ,933 3, ,814 3, ,164 3, ,397 3, ,453 3, ,389 3, ,733 3, ,433 2, ,485 2, ,651 2, OPA y = -0,0136x + 4,2571 R² = 0,943 OPA-03 Linear (OPA-03) ALEL DNA X Y ukuran basa dari larik Alel 1 78,03 3, ,82 Alel 2 82,27 3, ,94 Alel 3 85,44 3, ,77 Alel 4 88,97 3, ,61 Alel 5 98,49 2,92 827,14 Alel 6 107,31 2,80 627,52 Alel 7 111,55 2,74 549,62 Alel 8 115,08 2,69 492,13 Alel 9 119,66 2,63 426,30 Alel ,48 2,59 390,24 Alel ,95 2,56 361,19 Alel ,72 2,53 341,78 Alel ,244 2,49 306,04 Alel ,769 2,36 227,11

9 61 Lampiran 8. Panjang fragmen DNA primer OPA-09 Jarak fragmen (mm) Log bp Antilog (INV- LOG) (bp) 71,614 4, ,494 3, ,2 3, ,611 3, ,786 3, ,314 3, ,606 3, ,778 3, ,594 3, ,825 2, ,642 2, ,808 2, ,00 4,00 2,00 0,00 Primer OPA y = -0,0163x + 4,9133 R² = 0,9219 Primer OPA-09 Linear (Primer OPA-09) ALEL DNA X Y ukuran basa dari larik Alel 1 119,95 2,96 908,23 Alel 2 123,12 2,91 806,20 Alel 3 125,24 2,87 744,65 Alel 4 127,71 2,83 678,72 Alel 5 131,59 2,77 586,74 Alel 6 138,29 2,66 456,24 Alel 7 142,88 2,58 384,09 Alel 8 146,40 2,53 336,46 Alel 9 149,93 2,47 294,73 Alel ,81 2,41 254,79 Alel ,28 2,37 232,23 Alel ,46 2,31 206,14

10 62 Lampiran 9. Hasil amplifikasi primer OPA-17 OPA-11 OPA-06 OPA-07 OPA-14 OPA-20

11 63 Lampiran 10. Hasil interpretasi pita DNA dengan primer OPA-09 ukuran L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS2 ST1 ST2 A1 A2 basa dari larik (bp) 908, Alel 1 806, Alel 2 744, Alel 3 678, Alel 4 586, Alel 5 456, Alel 6 384, Alel 7 336, Alel 8 294, Alel 9 254, Alel , Alel , Alel 12

12 64 Lampiran11. Hasil interpretasi pita DNA dengan primer OPA-03 ukuran L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS2 ST1 ST2 A1 A2 basa dari larik (bp) 1569, Alel , Alel , Alel , Alel 4 827, Alel 5 627, Alel 6 549, Alel 7 492, Alel 8 426, Alel 9 390, Alel , Alel , Alel , Alel , Alel 14

13 65 Lampiran 12. Hasil interpretasi pita DNA dengan primer OPA-3 dan OPA-9 ukuran L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS2 ST1 ST2 A1 A2 basa dari larik (bp) 1569, Alel , Alel , Alel , Alel 4 827, Alel 5 627, Alel 6 549, Alel 7 492, Alel 8 426, Alel 9 390, Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel , Alel 26

14 66 Lampiran 13. Indeks Koefisien Kesamaan Genetik simple matching OPA-03 Output: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 07/06/ :13: Input parameters Read input from file: opa-3(1) Format: width=9 decimals=4 Page width: 80 Field width: 9 Decimal places: 4 Page width: 80 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\opa-3.nts, coeff=sm by Cols type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS L L DS DS SG SG SS SS ST ST A A ST1 ST2 A1 A ST ST A A SAHN: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 09/06/2013 7:17: Input parameters Read input from file: opa-3(1)

15 67 Save result tree in output file: opa-3-(2) Clustering method: UPGMA In case of ties: FIND Max. no. tied trees: 25 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\opa-3.nts, coeff=sm by Cols type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) Results will be stored in file: opa-3-(2) Searching for all tied trees

16 68 Lampiran 14. Indeks Koefisien Kesamaan Genetik simple matching OPA-09 Output: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 07/06/ :57: Input parameters Read input from file: opa9(2) Format: width=9 decimals=4 Page width: 80 Field width: 9 Decimal places: 4 Page width: 80 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\opa9(1).nts, coeff=sm by Cols type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS L L DS DS SG SG SS SS ST ST A A ST1 ST2 A1 A ST ST A A SAHN: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 09/06/2013 7:57: Input parameters Read input from file: opa9(2)

17 69 Save result tree in output file: opa9(3) Clustering method: UPGMA In case of ties: FIND Max. no. tied trees: 25 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\opa9(1).nts, coeff=sm by Cols type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) Results will be stored in file: opa9(3) Searching for all tied trees Solution tree number 1 Sorting tree nodes... done. Solution tree number 2 Sorting tree nodes... done. Solution tree number 3 Sorting tree nodes... done. Solution tree number 4 Sorting tree nodes... done. A total of 4 tied trees were found (note: some trees may be duplicates)

18 70 Lampiran 15. Indeks Koefisien Kesamaan Genetik simple matching OPA-03 DAN OPA-09 " Output: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 07/06/ :03: Input parameters Read input from file: gabungan(1) Format: width=9 decimals=4 Page width: 80 Field width: 9 Decimal places: 4 Page width: 80 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\gabungan.nts, coeff=dice by Cols, += , -= type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) L1 L2 DS1 DS2 SG1 SG2 SS1 SS L L DS DS SG SG SS SS ST ST A A ST1 ST2 A1 A ST ST A A SAHN: NTSYSpc 2.02, (C) , Applied Biostatistics Inc. Date & time: 09/06/2013 7:54: Input parameters Read input from file: gabungan(1) Save result tree in output file: gabungan(2)

19 71 Clustering method: UPGMA In case of ties: FIND Max. no. tied trees: 25 Comments: SIMQUAL: input=d:\kuliah\skripsi\rapd excel\gabungan.nts, coeff=dice by Cols, += , -= type=3, size=12 by 12, nc=none (similarity) Results will be stored in file: gabungan(2) Searching for all tied trees Solution tree number 1 Sorting tree nodes... done. A single tree was found

20 72 Lampiran 16. Prosedur Analisis Data NTSYS pc 1. Data pita hasil amplifikasi diubah menjadi data biner (1 dan 0) kemudian dimasukan ke dalam Excel. Baris pertama kolom A diisi dengan angka 1, kolom B untuk jumlah variable yang diamati (total larik), dan kolom C diisi dengan jumlah sampel. Data kemudian disimpan dalam bentuk Excel format penyimpanan , lalu program Excel ditutup. 2. Program Ntedit dibuka, lalu pilih File, Import file, using OLE, lalu pilih file yang akan di import, save file as.

21 73 3. Program NTSYS dibuka lalu pilih menu Similarity untuk analisa kesamaan genetik, kemudian pilih menu program Simqual karena data yang dimasukkan adalah data kualitatif dalam bentuk biner (1 dan 0). Menu yang terdapat pada Simqual dan inputnya adalah sebagai berikut: Input file : Nama file data scoring berbentuk NTSYS file By rows : COL sebagai default, tidak perlu diklik Coefficient : DICE sebagai default koefisien kemiripan, dapat diganti sesuai kebutuhan Output file : Nama file output hasil olahan Simqual Positive Code : 1 Negative Code : 0 Untuk mengetahui output olahan Simqual, dapat dilihat dengan menggunakan program General kemudian pilih menu Output, lalu diisikan nama file olahan Simqual.

22 74 4. Buka menu Clustering untuk mengolah hasil analisa Simqual menjadi bentuk klaster/dendogram kemudian klik menu SAHN. Menu dan isian pada program Clustering adalah sebagai berikut: Name of input matrix : nama file hasil olahan Simqual Name for Output matrix : nama file hasil olahan Clustering Method : UPGMA, default koefisien penghitungan, dapat diganti dengan mengklik tanda panah In case of ties : WARN sebagai default, bisa diganti dengan FIND Maximum no. Tied trees : default 25 Tie Tolerance : default 0 Show tree? : default YES Beta : default Listing file : default CON

23 Output berupa gambar fenogram dapat dilihat dengan meng-klik kotak fenogram berwarna merah 75