Effect of Platelet Shelf-Life on Human Platelet Lysates as FBS Substitute Against

Transkripsi

1 Effect of Platelet Shelf-Life on Human Platelet Lysates as FBS Substitute Against Protein Profile of HUVEC Culture Medium Benita Kurniawan, Agnes Henny Puspitasari, Widurini Djohan, Lisa Amir Corresponding address: Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Universitas Indonesia. Jalan Salemba Raya No. 4 Jakarta Pusat Indonesia. Phone: , Fax: Corresponding address: lisa.amir@gmail.com

2 Abstract Background: The effect of Human Platelet Lysates (HPL) derived, from platelets that have passed normal shelf life was unknown on HUVEC. Objective: To determine shelf-life effect on HPL as FBS alternative on HUVEC protein profile. Method: HUVEC were cultured with FBS, fresh, extended HPL, and analyzed with SDS-PAGE. Results: Band intensity of fresh HPL tended to be higher. Band thickness of HPL higher than FBS in band 4 th row band, and lower in 3 rd row band. No difference were observed in protein molecular weight range between HPL fresh, extended, FBS. Conclusion: HUVEC protein profile cultured with fresh, extended HPL is identical with FBS. Abstrak Latar Belakang: Human Platelet Lysates (HPL) yang berasal dari platelet yang melewati masa simpan belum diketahui efeknya pada kultur HUVEC. Tujuan: Mengevaluasi pengaruh waktu penyimpanan platelet pada HPL terhadap profil protein HUVEC. Metode: HUVEC dikultur dengan FBS, HPL fresh, dan HPL extended diuji dengan SDS-PAGE. Hasil: Intensitas band HPL fresh dan extended cenderung lebih tinggi. Ketebalan band HPL fresh dan extended lebih tinggi dibandingkan FBS pada band 4, dan lebih rendah pada band 3. Kisaran berat molekul protein HPL fresh dan extended tidak berbeda dibandingkan FBS. Simpulan: Profil protein HUVEC menggunakan HPL fresh dan extended identik dengan FBS. Keywords: Fetal Bovine Serum (FBS), Human Platelet Lysate (HPL), Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC), Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), protein profile

3 PENDAHULUAN Medium pada kultur sel berfungsi menyediakan nutrisi-nutrisi penting untuk metabolisme dan proliferasi sel. Medium kultur biasanya ditambahkan dengan serum, yang merupakan campuran kompleks biomolekul dengan faktor pertumbuhan. Fungsi utama serum adalah menyediakan faktor pertumbuhan yang memicu pertumbuhan dan proliferasi sel, memfasilitasi proses transport protein, mineral, lemak, serta menstabilkan ph. Serum yang umum digunakan sebagai suplemen medium kultur adalah serum yang berasal dari hewan seperti Fetal Bovine Serum (FBS) maupun Fetal Calf Serum (FCS). 1 Fetal Bovine Serum (FBS) mempunyai komposisi utama bovine serum albumin, selain itu FBS juga mengandung molekul-molekul kecil seperti asam amino, gula, lemak, dan hormon. FBS sering digunakan sebagai suplemen medium kultur dikarenakan kandungan gamma globulinnya (immunoglobulin) yang rendah. Kandungan gamma globulin yang tinggi dapat memberikan efek yang tidak diinginkan yaitu membuat sel kultur mengalami proses lisis. 2 Penggunaan FBS sendiri dalam kultur sel memiliki beberapa kerugian yaitu adanya risiko kontaminasi patogen, cara pengambilan yang tidak etis terhadap hewan, ketersediaan yang terbatas, dan harga yang mahal, sehingga diperlukan alternatif serum yang lain. 1 Pada terapi sel untuk suatu pengobatan, Good Laboratory Practice (GLP) wajib dijalankan, salah satunya dengan menghindari penggunaan media kultur yang tidak berasal dari hewan pada kultur sel. 3,4 Serum dan plasma manusia adalah alternatif FBS yang disarankan karena dapat dilakukan pengujian patogen sebelum diproses. Beberapa alternatif FBS adalah thrombinactivated platelet, human platelet lysate, platelet rich plasma, pooled human serum (HuS), dan plasma darah. 5 Salah satu alternatif pengganti serum FBS adalah Human Platelet Lysate (HPL). 6 Platelet mengandung faktor pertumbuhan yang berperan dalam perbaikan jaringan, diantaranya adalah platelet-derived growth factor (PDGF), fibronektin, fibrinogen, transforming growth

4 factor-β (TGF-b), insulin-like growth factor (IGF), epidermal growth factor (EGF), serotonin, dan fibroblast growth factor (FGF). Untuk mendapatkan HPL, platelet melalui proses lisis, antara lain dengan melakukan pembekuan dan pencairan untuk melepaskan faktor pertumbuhan tersebut. 7 Pada kultur adipose-derived stromal cells (ASC), HPL terbukti dapat meningkatkan tingkat proliferasi dan perlekatan sel, juga memiliki profil cell marker yang tidak jauh berbeda jika dibandingkan dengan menggunakan FBS. 8 Platelet memiliki masa simpan yang pendek sekitar 5 hingga 7 hari, dan setelah itu platelet akan dibuang karena meningkatnya risiko kontaminasi patogen. 9 Tulang adalah jaringan yang kaya akan pembuluh darah. Vaskularisasi merupakan hal yang penting dalam hemostasis dan regenerasi tulang. Pembuluh darah dan sel tulang saling berhubungan, karena itu proses angiogenesis mempengaruhi pertumbuhan tulang dan penyembuhan injuri fraktur tulang. 10 Sel endotel merupakan sel yang berperan dalam proses angiogenesis pembuluh darah. 11 Salah satu faktor yang berperan dalam angiogenesis adalah Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). 10 Beberapa penelitian telah meneliti peran Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) dalam pembentukan jaringan tulang. Pada bone graft, matriks ekstraseluler HUVEC berperan dalam differensiasi osteogenik dari human bone marrow mesenchymal stem cells (hmsc). 12 Selain itu, HUVEC berperan dalam membentuk jaringan mikrovaskular pada tissue engineered bone graft. Sel HUVEC yang dikultur dengan faktor pertumbuhan spesifik seperti vascular endothelial growth factor (VEGF), dapat membentuk vaskularisasi yang fungsional pada bone graft. 13 Pengaruh masa simpan platelet untuk pembuatan HPL ini telah diteliti dalam kultur sel yang menggunakan human bone marrow mesenchymal stem cells (hmsc) dan renal epithelial cell, tetapi efeknya pada HUVEC belum diketahui. 1,9 Berdasarkan hal ini, maka penulis tertarik untuk meneliti profil protein pada HUVEC. Tujuan penelitian ini adalah

5 untuk mengetahui pengaruh waktu penyimpanan platelet pada Human Platelet Lysates sebagai alternatif FBS terhadap profil protein HUVEC. METODE PENELITIAN Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorik. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium hasil kultur sel HUVEC selama 3 dan 15 hari. Bahan yang diuji pada penelitian ini adalah serum FBS, HPL fresh, dan HPL extended sebagai suplemen medium kultur HUVEC. HPL fresh dan HPL extended akan dibandingkan dengan FBS sebagai kontrol pada kultur HUVEC. HPL didapatkan dari proses pembekuan dan pencairan platelet. Sebelumnya dilakukan filtrasi terlebih dahulu pada platelet. Platelet kemudian dibekukan pada suhu C dan dicairkan pda suhu 37 0 C. Untuk HPL fresh diproses dari platelet yang belum melewati masa simpan berumur 5 hari, sedangkan HPL extended diproses dari platelet yang telah melewati masa simpan berumur 10 hari. Medium kultur HUVEC yang masing-masing disuplemen dengan FBS, HPL fresh, dan HPL extended kemudian diuji dengan metode SDS-PAGE untuk dilihat profil protein, yang mencakup intensitas band, ketebalan band, dan kisaran berat molekul. Dengan mengetahui intensitas suatu band, maka dapat diperkirakan banyaknya jumlah protein di dalam suatu kisaran berat molekul. Ketebalan suatu band menunjukkan perkiraan persebaran dari protein tersebut. Dengan mengetahui kisaran berat molekul maka dapat diketahui kandidat protein di dalam suatu band. Analisis profil protein dilakukan pada band 3 dan 4, yang adalah band yang paling jelas terlihat. Intensitas dan ketebalan band dianalisa secara semi-kuantitatif dengan menggunakan program Image J, sedangkan kisaran berat molekul dianalisa secara kualitatif dengan Gel Doc.

6 Data intensitas band kemudian dianalisis dengan uji normalitas Saphiro-Wilk. Data yang normal kemudian diuji dengan uji One-Way ANOVA dan data yang tidak normal diuji dengan uji Kruskal-Wallis. Dilakukan pula uji T-test untuk melihat perbandingan antara kelompok kultur 3 dan 15 hari. Uji statistik pada penelitian ini memiliki tingkat signifikansi 0,05 (p = 0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). HASIL PENELITIAN Data intensitas band 3 dapat dilihat pada Gambar. 1 dan data intensitas band 4 dapat dilihat pada Gambar. 2. Setelah dilakukan uji normalitas pada data, hasil uji data intensitas band ketiga dan keempat selama 3 hari kultur mempunyai distribusi data tidak normal sehingga dilanjutkan dengan uji Kruskal Wallis. Setelah uji Kruskal Wallis, tidak ditemukan perbedaan yang bermakna antara intensitas antar kelompok sampel kontrol dan perlakuan pada kultur 3 hari (p>0,05). Setelah diuji pada kelompok sampel kultur 15 hari, hasil intensitas pada band ketiga dan keempat memiliki ditribusi data yang normal dan homogen, sehingga dilanjutkan pada uji statistik Oneway ANOVA, dan ditemukan perbedaan rerata intensitas yang bermakna. Hasil rerata intensitas protein yang menggunakan HPL fresh sebagai serum mempunyai hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol FBS. HPL extended mempunyai kecenderungan intensitas yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan FBS, tetapi secara statistik tidak memiliki perbedaan yang bermakna (p>0,05). HPL fresh dan HPL extended tidak memiliki perbedaan intesitas yang signifikan secara statistik antara keduanya. Setelah dilakukan uji normalitas pada kelompok FBS band 3, maka hasilnya adalah data tidak normal, sehingga dilanjutkan kepada uji Post Hoc Mann Whitney. Uji normalitas pada data kelompok lain menunjukkan bahwa data normal sehingga dilanjutkan pada uji T- test. Hasil uji menunjukkan perbedaan yang signifikan antara intensitas kelompok 3 dan 15

7 hari pada kelompok FBS band 3. Terlihat penurunan angka intensitas pada band FBS 15 hari dibandingkan dengan FBS 3 hari. Data rerata ketebalan band 3 dapat dilihat pada Gambar.3 dan data rerata ketebalan band 4 dapat dilihat pada Gambar. 4. Pada band ketiga baik pada kelompok kultur 3 maupun 15 hari, rerata nilai ketebalan band ketiga SDS PAGE paling tinggi adalah kelompok FBS dibandingkan dengan HPL Fresh dan HPL Extended. Dengan nilai ketebalan yang lebih tinggi ini, maka FBS memiliki persebaran protein yang lebih luas. Pada band keempat kelompok kultur 3 maupun 15 hari, kelompok HPL fresh mempunyai rerata nilai ketebalan yang paling tinggi. Sehingga HPL fresh memiliki persebaran protein yang paling luas dibandingkan dengan kelompok yang lain. Persebaran protein yang lebih luas berarti kandidat protein yang di dalam suatu band menjadi lebih banyak. Identifikasi profil protein secara kualitatif dilihat melalui perbandingan band-band kelompok perlakuan dan kelompok kontrol (Gambar 5). Pada analisa berat molekul, maka band akan dibandingkan dengan standar. Pada band ketiga kelompok kultur 3 hari, kisaran berat molekul protein paling luas dimiliki oleh HPL extended (79,20-114,22), diikuti oleh FBS (78,62 100,88) dan HPL fresh (89,73 104,64). Sedangkan pada kelompok kultur 15 hari, kelompok sampel yang memiliki kisaran berat molekul paling luas adalah FBS (74,22 99,31) diikuti oleh HPL extended (88,1 108,04) dan HPL fresh (93,56 106,04). Beberapa kandidat protein yang termasuk di dalam band ketiga adalah CD105 (Endoglin). CD62E (E-selectin), CD141 (Thrombomodulin), CD34, CD106 (VCAM-1), dan CD146. Pada band keempat kelompok kultur 3 hari, kisaran berat molekul paling luas juga dimiliki oleh HPL extended (53,33-78,82) diikuti oleh HPL fresh (53,38 76,82) dan FBS (54,55 73,05). Sedangkan, pada kelompok kultur 15 hari, kelompok sampel yang memiliki

8 kisaran berat molekul band keempat paling luas adalah HPL fresh (55,48 73,77), lalu HPL extended (58,16 76,02), dan FBS (55,84 71,5). Beberapa kandidat protein yang ada pada band keempat adalah CD147 dan CD102 (ICAM-2). HPL extended cenderung memiliki kisaran berat molekul yang luas, bila dibandingkan dengan FBS maupun HPL fresh. DISKUSI Dilihat dari intensitas band 3 dan band 4 kelompok kultur 3 hari, FBS, HPL fresh, dan HPL Extended tidak memiliki perbedaan yang signifikan. Hal ini mengindikasikan, protein dengan kisaran berat molekul 53,33-114,22 kda memiliki jumlah yang sama. Pada kelompok kultur 15 hari, HPL fresh dan HPL extended memiliki nilai intensitas yang lebih tinggi dibandingkan FBS. Perbedaan yang signifikan terdapat antara nilai intensitas FBS dengan HPL fresh. Hal ini disebabkan oleh penurunan nilai intensitas yang signifikan pada FBS 15 hari bila dibandingkan dengan FBS 3 hari. Kemungkinan penurunan jumlah protein pada FBS disebabkan oleh penurunan proliferasi sel, seperti yang dilaporkan pada penelitian sebelumnya bahwa proliferasi sel yang dikultur dengan FBS cenderung menurun seiring bertambahnya waktu kultur. 14 Proliferasi yang menurun menyebabkan protein yang disekresikan sel turut menurun. Sebaliknya, pada kelompok HUVEC yang dikultur dengan HPL fresh dan HPL extended, peningkatan proliferasi sel masih bertahan sampai kultur hari ke- 15. Beberapa protein HUVEC yang dapat memicu proliferasi sel yang terdapat pada band 3 dan 4 adalah CD146, CD34, dan CD105 (Endoglin). Jumlah protein yang stabil selama masa perlakuan pada kelompok sel HUVEC yang dikultur dengan HPL fresh dan HPL extended mungkin berhubungan dengan aktivitas proliferasi HUVEC yang tinggi.

9 Pada band 3, persebaran protein yang paling luas dilihat dari ketebalan band terdapat pada FBS, dan nilai persebaran menurun pada HPL fresh dan extended. Tetapi pada band 4, persebaran protein HPL fresh dan extended lebih luas dibandingkan dengan FBS. Persebaran protein yang luas pada suatu band mengindikasikan kemungkinan kandidat protein yang diekspresikan pada proses kultur menjadi semakin banyak karena meluasnya kisaran berat molekul protein. SDS-PAGE adalah metode analisis profil protein berdasarkan berat molekul, sehingga kandidat protein yang terekspresikan hanya bisa diasumsikan berdasarkan berat molekul. Pada band ketiga dengan kisaran berat molekul 74,22-114,22 kda, kemungkinan kandidat protein yang terekpresikan adalah CD105/Endoglin (95 kda) dan CD34 ( kda). CD105/Endoglin (95 kda), merupakan komponen pro-angiogenic di dalam sel endotel. 15 CD105 merupakan reseptor dari transforming growth factor- β (TGF-β). 15,16 TGF-β merupakan salah satu faktor yang berperan dalam proses angiogenesis. 10 Pada penelitian yang meneliti dengan tikus yang memiliki tingkat CD105 rendah, terjadi defek vaskularisasi sehingga menyebabkan kematian tikus. 17 Penelitian lain menunjukkan kemampuan sel endotel untuk membentuk jaringan kapiler dengan menggunakan sistem 3 dimensi kolagen matriks dan membuktikan bahwa sel yang mengalami defisiensi CD105 menyebabkan pengurangan panjang struktur kapiler oleh TGF-β. 18 CD34 ( kda) merupakan salah satu kandidat protein lain dalam band 3. CD34 mempunyai kemampuan untuk membentuk filopodia, yang merupakan karakteristik tip cells. 19 Tip cell adalah sel yang mengawali proses percabangan vaskular yang mengatur serangkaian proses angiogenesis. 16 Tingkat sekresi CD34 bergantung pada molekul regulator seperti VEGF, TNF-αNotch, dan ligand DLL4. VEGF diketahui memicu angiogenesis, dengan ekspresi CD34 pada tip cell filopodia, sehingga CD34 dan VEGF saling berhubungan satu sama lain. 19 VEGF merupakan regulator penting dalam proses angiogenesis dan juga

10 mempunyai peran dalam pertumbuhan skeletal. VEGF berperan dalam proses signalling pada awal angiogenesis dan rekuitmen dari osteoblas, osteoklas, dan sel haematipoetik yang merupakan awal dari osifikasi primer. 5 VEGF juga memicu migrasi dan proliferasi dari sel endotel. 20 VEGF merupakan stimulator spesifik yang utama terhadap proliferasi sel endotel, yang bekerja melalui 2 reseptor tyrosine kinase VEGFR1 (FLT1) dan VEGFR 2 (KDR). 21 Sedangkan pada band keempat dengan kisaran berat molekul 53,33-78,82 kda, salah satu kemungkinan kandidat protein adalah CD102 atau ICAM-2 (60 kda). ICAM-2 (60 kda) berperan dalam proses angiogenesis. ICAM-2 mengaktivasi guanosine triphosphatase (GTPase) Rac, yang dibutuhkan dalam formasi pembuluh darah yang baru. Guanosine triphosphatase (GTPase) Rac merupakan regulator transduksi sinyal kepada sitoskeleton. Adhesi molekul ICAM-2 dan aktivasi dari GTPase Rac merupakan dua hal penting dalam proses angiogenesis. Pada suatu penelitian yang menggunakan tikus, membuktikan bahwa tingkat ekspresi ICAM-2 yang rendah dapat menyebabkan defek angiogenesis baik secara in vivo dan in vitro. 22 Kombinasi terapi sel punca dan faktor pertumbuhan untuk proses angiogenesis dan osteogenesis terus diteliti untuk regenerasi tulang. 10 Jaringan pembuluh darah merupakan hal penting bagi rekayasa jaringan tulang agar dapat terintegrasi dengan jaringan pasien. 13,49 Hasil penelitian ini menunjukan HPL extended yang dihasilkan dari platelet yang telah melewati masa simpan dapat merangsang pertumbuhan sel yang setara dengan HPL fresh maupun FBS. KESIMPULAN Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa profil protein pada kultur HUVEC dengan menggunakan HPL fresh dan HPL extended sebagai alternatif FBS tidak memiliki perbedaan yang signifikan.

11 DAFTAR PUSTAKA 1. Rauch C, Feivel E, Amann EM, et al. Alternatives to The Use of Fetal Bovine Serum: Human Platelet Lysates as a Serum Substitute in Cell Culture Media. Altex 2011;28: Johnson M Fetal Bovine Serum. United States: Labome Accessed WHO Handbook: Good Laboratory Practice (GLP): Quality Practices for Regulated Non-Clinical Research and Development - 2nd ed Switzerland: WHO " Accessed 1 Desember Unger C, Skottman H, Blomberg P, Dilber MS, Hovatta O. Good Manufacturing Practice and Clinical-Grade Human Embryonic Stem Cell Lines. Human Mol Genet 2008;17(1): Aldahmash A, Sørensen MH, Al-Nbaheen M, et al. Human Serum is as Efficient as Fetal Bovine Serum in Supporting Proliferation and Differentiation of Human Multipotent Stromal (Mesenchymal) Stem Cells In Vitro and In Vivo. Stem Cell Rev Rep 2011;7(4): Chen B, Sun H, Wang H, et al. The Effects of Human Platelet Lysate on Dental Pulp Stem Cells Derived From Impacted Human Third Molars. Biomater 2012;33: Mirabet V, Solves P, Minana MD, et al. Human Platelet Lysate Enhances the Proliferative Activity of Cultured Human Fibroblast-Like Cells From Different Tissues. Cell Tissue Bank 2008;9:2. 8. Naaijkens BA, Niessen HWM, Prins H-J, et al. Human Platelet Lysate as a Fetal Bovine Serum Substitute Improves Human Adipose-Derived Stromal Cell Culture for Future Cardiac Repair Applications. Cell Tissue Res 2012;348(1):119.

12 9. Buch SMJ. Platelet Lysates Manufactured from Fresh and Expired Platelet Concentrates as a Culture Supplement for Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells: Effect on Morphology, Expansion, Osteogenic Differentiation and Immunomodulation [Iceland: University of Iceland; Kanczler J, Oreffo R. Osteogenesis and Angiogenesis: The Potential for Engineering Bone. Eur Cells Mater 2008;15: Sainson R, Johnston D, Chu H, et al. TNF Primes Endothelial Cells for Angiogenic Sprouting by Inducing a Tip Cell Phenotype. Blood 2008;111(10): Kang Y, Kim S, Bishop J, Khademhosseini A, Yang Y. The Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow MSCs on HUVEC-derived ECM and β-tcp Scaffold. Biomater 2012;33(29): Tsigkoua O, Pomerantsevaa I, Spencerc J, et al. Engineered Vascularized Bone Grafts. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(8): Heidari M, Tahmasebi MN, Etemad S, et al. In vitro Human Chondrocyte Culture; A Modified Protocol. Middle-East J of Scientific Res 2011;9(1): Duff S, Li C, Garland J, Kumar S. CD105 is Important for Angiogenesis: Evidence and Potential Applications. FASEB J 2003;17(9): Siemerink M, Klaassen I, Van Noorden C, Schlingemann R. Endothelial Tip Cells in Ocular Angiogenesis: Potential Target for Anti-Angiogenesis Therapy. J Histochem Cytochem 2012;61(2): Li D, Sorensen L, Brooke B, et al. Defective angiogenesis in mice lacking endoglin. Science 1999;284(5419): Li C, Hampson IN, Hampson L, et al. CD105 Antagonizes The Inhibitory Signaling of Transforming Growth Factor β1 on Human Vascular Endothelial Cells. FASEB J 2000;14(1):62.

13 19. Siemerink M, Klaassen I, Vogels I, et al. CD34 Marks Angiogenic Tip Cells in Human Vascular Endothelial Cell Cultures. Angiogenesis 2012;15(1). 20. Favot L, Keravis T, Holl V, Le Bec A, Lugnier C. VEGF-Induced HUVEC Migration and Proliferation are Decreased by PDE2 and PDE4 Inhibitors. Thromb Haemost. 2003;90(2): Herr D, Rodewald M, Fraser H, et al. Regulation of Endothelial Proliferation by The Renin-Angiotensin System in Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Reproduction. 2008;125(30). 22. Huang M, Mason J, Birdsey G, et al. Endothelial Intercellular Adhesion Molecule (ICAM)-2 Regulates Angiogenesis. Blood 2005;106(5): Rerata Intensitas Band (%) *** * FBS HPL Fresh HPL Extended 0 3 Hari 15 Hari Gambar 1. Gambar Grafik Rerata Intensitas Band 3 SDS-PAGE

14 Rerata Intensitas Band (%) * FBS HPL Fresh HPL Extended 0 3 Hari 15 Hari Gambar 2. Gambar Grafik Rerata Intensitas Band 4 SDS-PAGE (*) = signifikan (0,01 p 0,05) (***) = sangat signifikan (0,0001 p 0,001) 25 Rerata Ketebalan Band (pixel) FBS HPL Fresh HPL Extended 0 3 Hari 15 Hari Gambar 3.Gambar Grafik Rerata Ketebalan Band 3 SDS-PAGE

15 60 Rerata Ketebalan Band (pixel) FBS HPL Fresh HPL Extended 0 3 Hari 15 Hari Gambar 4. Gambar Grafik Rerata Ketebalan Band 4 SDS-PAGE Gambar 5. Gambaran Kisaran Berat Molekul HUVEC