THE EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA ON MESENCHYMAL STEM CELLs (MSCs) DIFERENTIATION INTO CHONDROBLAST I Gde Adi Widiastana*, Dwikora Novembri Utomo**

Transkripsi

1 THE EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA ON MESENCHYMAL STEM CELLs (MSCs) DIFERENTIATION INTO CHONDROBLAST I Gde Adi Widiastana*, Dwikora Novembri Utomo** * Resident of Orthopaedic &Traumatologi Dept, Dr. Soetomo General Hospital, Airlangga Univ. School of Medicine, Surabaya **Staff of Orthopaedic &Traumatologi Dept, Dr. Soetomo General Hospital, Airlangga Univ. School of Medicine, Surabaya Forewords: Analyzed whether adding platelet rich plasma to mesenchymal stem cell culture on growth media and chondrogenic media had any effect on stem cell s proliferation and diferentiation into chondroblast. Aims: Find out the effect of platelet rich plasma on mesenchymal stem cell s diferentiation and proliferation into chondroblast on invitro media. Methods: Randomized control group post test only design. Blood was taken from the rabbit s vein to be processed into platelet rich plasma (PRP). Mesenchymal Stem Cell (MSC) was harvested from the bone marrow of the rabbit to be cultured. The MSC s culture were divided into three groups of modification. The first group was combination of MSC added with Complete Culture Medium (CCM) and Chondrogenic Diferentation Medium (CDM) without PRP as control group.the second group had the same combination as the first group with extra 5% PRP. The third group had the same combination as the first group with extra 10% PRP. The results were evaluated in the following 21 days. Results: The group that received extra 5% PRP had significant increase of chondroblast count compared to the group without PRP addition (p=0,033). The same result also occured on the groups that received extra 10% PRP compared to the group without PRP addition (p=0,028). There were no significant diferences between both the second and the third groupchondroblast count (p=0,203). Conclusions: There was a significant effect of platelet rich plasma on mesenchymal stem cell s diferentiation and proliferation into chondroblast on invitro media Keywords : Chondroblast, Complete Culture Medium, Chondrogenic Differentiation Medium, Mesenchymal Stem Cell, Platelet Rich Plasma PENDAHULUAN Kartilago atau tulang rawan adalah suatu jaringan yang kuat, bersifat semi transparan, elastik dan fleksibel, yang terdiri dari kondrosit dan kondroblas yang tersebar di antara material lipoprotein, dan diperkuat oleh serat-serat kolagen. Bagian luar dari kartilago dilapisi oleh serabut membran yang tebal dan kuat yang

2 disebut sebagai perikondrium. Pada kartilago tidak ditemukan pembuluh darah dan saraf, sehingga jika terjadi kerusakan maka akan sulit terjadi penyembuhan. Kartilago sendi mempunyai beberapa fungsi, antara lain: sebagai penutup permukaan sendi, mengurangi gesekan antar tulang di sendi sehingga mencegah kerusakan, dan juga berperan sebagai penahan goncangan (Vinther, 2003). Degenerasi dan cedera pada tulang rawan sendi cenderung meningkat disebabkan oleh meningkatnya angka harapan hidup dan meningkatnya angka kejadian trauma. Secara alami tulang rawan sendi akan mengalami degenerasi dan regenerasi. Proses penyembuhan kartilago diatur oleh kondrosit yang memproduksi matriks ekstraseluler proteoglikan dan kolagen. Beberapa respons terhadap penyembuhan luka pada kartilago tidak akan diganti dengan tipe kolagen dan preoteoglikan yang sesuai dan akan menyebabkan fungsi yang abnormal. Terutama pada kartilago artikular, jika terjadi cedera maka akan sulit untuk regenerasi karena lambatnya aktivitas mitotik dari kondrosit dan jaringan yang avaskular. Meskipun dalam kondisi yang ideal, proses perbaikan kerusakan tulang rawan sendi masih sulit karena lambatnya proliferasi kondrosit jika dibandingkan dengan jaringan parut (Buckwalter, 1997). Beberapa cara untuk melakukan penanganan terhadap kerusakan tulang rawan sendi antara lain: Traditional Palliative (lavage, chondroplasty), bone marrow stimulation techniques (microfractures), osteochondral autologous transplantation, osteochondral allograft transplantation, cell-based therapy (Autologous Chondrocytes Implantation (ACI), Matrix Induced Chondrocytes Implantation (MACI), Mesenchymal stem cells (MSCs) implantation) (Gobbi, 2009 ; Getgood et al, 2009). Kemajuan di bidang kedokteran meliputi kedokteran molekuler, biologi molekuler, rekayasa jaringan dan genetik telah membuka cakrawala baru dalam penanganan berbagai macam kondisi kelainan sistem muskuloskeletal. Sebagai contoh kemampuan untuk mengisolasi dan kultur mesenchymal stem cells (MSCs) telah membuka wacana baru dalam pengobatan defek tulang rawan sendi. Mesenchymal stem cells (MSCs) adalah sel multipoten yang dapat berdeferensiasi ke dalam beberapa sel selama proses penyembuhan cedera jaringan. MSCs dapat berdeferensiasi

3 menjadi collagen, osteoblast pembentuk tulang, kondrosit pembentuk tulang rawan sendi dan lainnya. Sel itu secara bersama-sama mempunyai kemampuan untuk meregenerasi kerusakan jaringan yang disebabkan oleh cedera, perubahan degenerasi, dan osteoartritis (Vinther, 2003). Diferensiasi MSC menjadi berbagai jaringan seperti tulang, kartilago dan lemak telah dipelajari oleh banyak laboratorium. Seperti telah dijelaskan sebelumnya, stimulus dan lingkungan yang tepat akan menentukan diferensiasi MSC menjadi sel yang spesifik (Guilak, 2006). Diferensiasi MSC menjadi kondroblas atau disebut diferensiasi kondroblastik terjadi bila MSC ditumbuhkan pada media dengan kondisi yang memenuhi syarat tertentu yaitu dalam medium nutrisi yang bebas serum dan mengandung komponen TGF-β. Bila kondisi ini terpenuhi, MSC akan kehilangan morfologi fibroblastiknya dan mulai mengrekspresikan berbagai macam komponen matriks ekstraseluler. Proses ini melibatkan biosintesis glikosaminoglikan dan diikuti dengan perubahan morfologi sel. Pada proses awal kondrogenesis terdapat perubahan progresif dari struktur kondrotinsulfat yang dipengaruhi oleh TGF-β1, 2, dan 3. Selama proses diferensiasi, dengan pengaruh TGF-β, MSC akan mensitesis aggrecan, link protein, fibromodulin, decorin dan chondroadherin, komponen normal dari matriks kartilago (Russel, 2010). Pada perkembangan terbaru diketahui bahwa growth factor ternyata memegang peranan penting dalam melakukan regenerasi jaringan termasuk tulang rawan sendi. Tetapi, penjelasan tentang bekerjanya senyawa ini pada kondrosit belum dipaparkan secara utuh, namun nampaknya hal ini berhubungan dengan tempat reseptor sel permukaan pada sel yang bertanggung jawab. Beberapa growth factor yang sangat berpengaruh dalam tulang rawan sendi adalah transforming growth factor-beta (TGFβ), platelet derived growth factor (PDGF) dan insulin growth factor (IGF) dan lain-lain (Mankin, 1995). Platelet rich plasma selama ini banyak digunakan pada injeksi intraartikular. Diduga bahan ini dapat memperbaiki kerusakan tulang rawan karena PRP mengandung berbagai macam growth factor yang sama seperti yang diperlukan oleh MSCs untuk berdiferensiasi menjadi kondroblas. Salah satu growth factor

4 penting yang diperlukan adalah TGF-β (Guilak, 2006). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh platelet rich plasma terhadap mesenchymal stem cells yang dikultur dengan media pertumbuhan. Dianalisis apakah platelet rich plasma dapat berfungsi seperti media kondrogenik yang menyebabkan diferensiasi dan proliferasi dari MSCs menjadi kondroblas. METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini adalah eksperimental murni dengan rancangan penelitian Rancangan Acak Kelompok (RAK). Dilakukan pengukuran variabel pada hewan coba hanya setelah diberikan perlakuan (Pratiknya, 2008). Sampel penelitian ini hewan kelinci putih New Zealand jantan. Diambil darah vena dari kelinci tersebut untuk dibuat platelet rich plasma (PRP), kemudian diukur konsentrasi plateletnya. Kemudian dilakukan kultur Mesenchimal Stem Cell (MSCs) yang diambil dari Bone Marrow kelinci, ditumbuhkan pada media Complete Culture Medium (CCM) ditambah dengan Chondrosite Differentiation Medium (CDM), medium selanjutnya diganti setiap 3 hari dilakukan inkubasi selama 21 hari dalam suatu inkubator dengan suhu 37 C dengan CO2 5%. Pada kultur MSCs diberikan tiga perlakuan yaitu perlakuan pertama, Mesenchymal Stem Cell (MSCs) ditambahkan Complete Culture Medium (CCM) ditambah dengan Condrosit Differentiation Medium (CDM) tanpa PRP sebagai kontrol. Perlakuan kedua, Mesenchymal Stem Cell (MSCs) ditambahkan Complete Culture Medium (CCM) ditambah dengan Condrosit Differentiation Medium (CDM) ditambahkan 5% PRP dan pada medium ketiga Mesenchymal Stem Cell (MSCs) ditambahkan Complete Culture Medium (CCM) ditambah dengan Condrosit Differentiation Medium (CDM) ditambahkan 10% PRP. Setelah dilakukan kultur dan penggantian media secara berkala, maka dilakukan harvesting pada hari ke-21. Kemudian di lakukan pencucian pada masingmasing media kultur dan diferensiasi kondroblas diketahui dengan melakukan pemeriksaan Histopatologis, yaitu menghitung jumlah kondroblas yang terbentuk perlapang pandang mikroskop.

5 ALUR PENELITIAN 21 Hari P S MSCs + CCM CDM +Tanpa PRP CDM+ 5% PRP Ganti med/3 hr Ganti med/3 hr Histopatologis Penghitungan jumlah sel (kondroblas) CDM+ 10% PRP Ganti med/3 hr PEMBAHASAN Mesenchymal stem cells (MSC) dapat diisolasi dari banyak jaringan di tubuh. Saat ini, potensi sel ini pada proses perbaikan dan regenerasi jaringan musculoskeletal sedang dipelajari oleh banyak kelompok. MSC ini memiliki potensi untuk berdiferensiasi sesuai dengan lingkungannya. Sel ini tidak memiliki karakteristik jaringan yang spesifik tetapi di bawah stimulus yang tepat sel ini bisa berdiferensiasi menjadi sel yang spesifik (Barry, 2001). Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa dengan penambahan platelet rich plasma (PRP) pada kultur MSCs didapatkan peningkatan jumlah kondroblas yang terbentuk secara signifikan. Platelet rich plasma mengandung berbagai macam growth factor yang sama seperti yang diperlukan oleh MSCs untuk berdiferensiasi menjadi kondroblas. Salah satu growth factor penting yang diperlukan adalah TGF-β (Guilak, 2006). Platelet rich plasma (PRP) adalah autoloug product yang diproduksi dari whole blood melalui proses centrifuge gradient yang tinggi mempunyai konsentrasi platelet yang tinggi dalam volume plasma yang rendah. Platelet rich plasma berfungsi mempercepat

6 regenerasi endotelial, epitelial, dan epidermal, menstimuli angiogenesis, merangsang sintesa collagen, mempercepat penyembuhan jaringan lunak, menurunkan jaringan parut pada kulit, mempercepat respon homeostasis pada cedera, melawan efek penghambatan penyembuhan luka yang disebabkan oleh glukokortikoid Tingginya konsentrasi lekosit pada platelet rich plasma menambah efek anti mikrobal. Selain itu platelet rich plasma dikenalkan sebagai suatu produk autolog darah yang tidak memiliki efek penularan penyakit (Fuller, 2002). Platelet-rich Plasma (PRP) sebagai media yang mengandung banyak komponen faktor pertumbuhan adalah aplikasi baru di dunia kesehatan. Komponen yang terkandung dalam PRP antara lain adalah platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor β- 1dan β-2, platelet-derived epidermal growth factor (PDEGF), plateletderived angiogenesis factor (PDAF), insulin growth factor-1 (IGF-1), dan platelet factor-4 (PF-4). Faktor-faktor pertumbuhan ini berperan dalam regenerasi kartilago (Song, 2006). Peran dari PRP pada diferensiasi kondroblas telah ditunjukkan pada studi in vitro yang dilakukan oleh Weibrech. Weibrech mengamati efek mitogenik dari PRP pada sel kondroblas. Annunziata dan Lucarelli menunjukkan peningkatan pada pertumbuhan dan diferensisasi pada kartilago periodontal yang ditunjukkan oleh peningkatan aktivitas alkalinfosfatase dan ekspresi kolagen tipe II. Efek mitogenik dari PRP diduga berhubungan dengan perananan factor pertumbuhan atau growth factors. PRP juga mengandung plasma dan thrombin yang memiliki efek biologis yang berperan dalam penyembuhan dan regenerasi kartilago (Guilak, 2006).

7 Media yang digunakan adalah MSC dari kelinci yang dikultur secara in vitro untuk diberikan tiga perlakuan yang beda yaitu pemberian TGF-β1, PRP dengan kadar lima persen dan sepuluh persen. Bahan tersebut akan dibiarkan selama jangka waktu tertentu untuk memberikan kesempatan bagi MSC berproliferasi menjadi sel yang diharapkan yaitu kondroblas. Hasilnya, tidak ada perbedaan yang signifikan pada ketiga kelompok percobaan dalam jumlah kondroblas yang terbentuk. Hal ini menunjukkan bahwa PRP mengandung bahan-bahan yang dibutuhkan MSC untuk berproliferasi menjadi kondroblas (Hardingham, 1997). MSC memiliki potensi yang sangat besar untuk berproliferasi menjadi sel. Penelitian rekayasa jaringan semakin berkembang pesat setelah ditemukan cara untuk mengisolasi MSC dari makhluk hidup atau hewan coba untuk dikultur dan diberikan perlakuan sehingga bisa berproliferasi menjadi sel atau jaringan yang dikehendaki peneliti. Untuk berproliferasi menjadi kondroblas pada penelitian-penelitian in vitro sebelumnya digunakan beberapa media yaitu high density pellet culture, serum free media, dexamethasone, askorbat, Transforming Growth Factor-β, dan Bone Morphogenic Protein. Dalam perkembangannya juga sudah diketahui signaling pathway yang berperan pada proliferasi MSC menjadi kondroblas yaitu SMAD, WISP-3/Wnt signaling, MAPK, interaksi matriks ekstraselular kartilago sendi dan Sox-9 (Russel, 2010). Induksi proliferasi MSC menjadi kondroblas dipengaruhi beberapa faktor. Sebagai contoh, kondisi kultur yang kondusif bagi MSC untuk berproliferasi menjadi kondroblas adalah media dengan konsentrasi trombosit darah yang tinggi dengan media bebas serum yang

8 mengandung protein dan growth factor yang spesifik. Kelompok Transforming Growth Factor-β dan turunannya seperti Bone Morphogenic Protein. TGF-β1 awalnya sering digunakan dengan Wnt juga terlibat dalam homeostasis kartilago sendi manusia. Mutasi pada Wnt1-inducible signalling pathway protein 3 (WISP-3) diasosiasikan dengan kelainan pada media kultur MSC sebagai progresive pseudorhematoid dysplasia. penginisiasi proliferasi kondroblas, meskipun sekarang TGF-β3 menunjukkan hasil yang lebih meyakinkan sebagai inisiator aktivitas proliferasi kondrogenik MSC. Anggota lain dari kelompok TGF-β1 yaitu BMP-6 mampu meningkatkan ukuran dan berat media kultur karena Pasien dengan kelainan tersebut akan mengalami kerusakan kartilago sendi secara progresif seiring dengan bertambahnya umur disertai kerusakan pada tulang. Protein WISP termasuk dalam kelompok yang sama dengan protein growth factor pada jaringan ikat yang diregulasi oleh TGF. WISP-3 kemampuannya meningkatkan diekspresikan pada kartilago sendi dan produksi matriks proteoglikan. BMP-2 dan BMP-9 juga digunakan dalam kultur MSC tiga dimensi sebagai induksi dari proliferasi kondrogenik (Koschell, 2004). Selain growth factor, terdapat signaling pathway yang juga berhubungan dengan aktivitas kondrogenik MSC. Wnt dan protein signalling lainnya yang berhubungan Wnt lain yaitu Wnt 11 diekspresikan pada saat pertumbuhan kartilago. Keduanya mengalami up-regulation pada saat kondrogenesis dari MSC sehingga menunjukkan keterlibatan signalling Wnt pada diferensiasi MSC menjadi kondroblas (Song, 2004). Signaling lain yang terlibat dalam proses kondrogenesis MSC adalah p38 mitogen-activated protein

9 kinase (p38 MAPK). Penelitian menunjukkan MAPK sebagai target dari TGF β-1, BMP-2 dan growth/diferentiation factor 5 (GDF 5) dalam diferensiasi kondrogenik pada hewan coba tikus. MAPK yang lain, extracellular signal-regulated kinase (ERK) juga meningkat konsentrasi dan aktivitasnya saat TGF-β ditambahkan pada MSC (Barry, 2001). PRP memiliki banyak growth factor dalam konsentrasi tinggi setelah diaktivasi thrombin dan kalsium. Growth Factor yang dominan antara lain platelet derived growth factor PENUTUP Simpulan Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa platelet rich plasma (PRP) berpengaruh terhadap proliferasi dan diferensiasi mesenchymal stem cell (MSC) menjadi chondroblast. Kadar PRP 5% ataupun 10% berpengaruh terhadap diferensiasi MSC menjadi chondroblast. Saran Perlu diteliti lebih lanjut peranan PRP dalam cartilage engineering pada binatang coba. (PDGFaa, PDGFbb, PDGFab), transforming growth factor beta(tgfβ, TGF-β2), vascularendothelial growth factor (VEGF), and epithelial growth factor (EGF). Proliferasi kondrogenik terutama dipengaruhi oleh PDGF, TGF-β1 dan IGF sehingga ketiga growth factor inilah yang paling diteliti kaitannya dengan diferensiasi DAFTAR PUSTAKA Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM. (2001). Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix MSC (Jiang, 2002).

10 components. Experimental Cell Research, 268, BreinanHA, Minas T, Hsu H-P, Nehrer S, Sledge CB, Spector M. (1997). Effect of cultured autologous chondrocytes on repair of chondral defects in a canine model. J.Bone Joint Surg. 1997; 79-A: Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L. (1994). Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.n. Engl. J. Med. Bruns J, Kersten P, Lierse W, Weiss A, Silbermann M. (1994). The in vitro influence of different culture conditions on the potential of sheep rib perichondrium to formhyalinelike cartilage. Evaluation of glueing materials used for in vivo graft fixation. J. Virchows Archiv. 1994; 424: Buckwalter JA, Mankin HJ. (1997). An Instructional Course Lecture.J Bone Joint Surg A; ; 331: