ABSTRACT. Tjok Agung Y. Vidyaputra. KEYWORDS: VEGF, Calcium Sulfate, bone defects, osteoblast, type I collagen, bone recycling, liquid nitrogen

Transkripsi

1 ABSTRACT VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) IN CALCIUM SULFATE INDUCES MORE OSTEOBLASTS AND TYPE I COLLAGEN IN RATS WITH FEMUR BONE DEFECTS AFTER BONE RECYCLING GRAFT WITH LIQUID NITROGEN Tjok Agung Y. Vidyaputra INTRODUCTION. Bone defects can be caused by trauma, neoplasms, congenital defects and infections. Reconstruction of bone defects to achieve ideal bone lengths and achieve union of the bone is still a challenge. The expression of growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) may stimulate bone healing process. Calcium sulfate is useful biomaterials conductor of growth factors such as VEGF. Administration VEGF in Calcium sulfate can help the process of bone regeneration by stimulating osteoblast proliferation and differentiation and the synthesis of type I collagen which can help regenerate bone defect. METHODS. The experimental study with randomized post-test only control group design with a sample of 32 male Wistar rats. These mice were then divided into two groups, and adapted for 1 week prior to the making defect on mice femur bone and bone recycling was done with liquid nitrogen. The first group were given VEGF in calcium sulfate bone graft, the second group were given only calcium sulfate bone graft. Wound care was done every day for 1 week. During the fourth week, removal of bone defect for examination of the expression of type I collagen and the number of osteoblast cells was done. RESULTS. The average number of osteoblast found on the rat that are given VEGF and calcium sulfate ( ± ) more than given calcium sulfate only. ( ± ), inferential test using independent t-test showed significant different on osteoblast number between two groups, p=0.000 (p<0,05). Expression of type I collagen is higher on samples that is given VEGF inside calcium sulfate with mean rank compare with calcium sulfate only, mean rank Using Mann-Whitney U it is found a significant different of type I collagen expression between two groups with p=0.000 (p<0.05). CONCLUSIONS. Provision of VEGF in calcium sulfate in rats with femur bone defects after bone recycling with liquid nitrogen, had more number of osteoblasts and higher expression of type I collagen was higher when compared to provision of calcium sulfate only. KEYWORDS: VEGF, Calcium Sulfate, bone defects, osteoblast, type I collagen, bone recycling, liquid nitrogen viii

2 ABSTRAK VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) DALAM CALCIUM SULFATE MENGINDUKSI LEBIH BANYAK SEL OSTEOBLAS DAN KOLAGEN TIPE 1 PADA DEFEK TULANG FEMUR TIKUS SETELAH DILAKUKAN BONE RECYCLING GRAFT DENGAN NITROGEN CAIR Tjok Agung Y. Vidyaputra PENDAHULUAN. Defek tulang dapat disebabkan oleh trauma, neoplasma, defek kongenital dan infeksi. Rekonstruksi defek tulang untuk mencapai panjang tulang yang ideal dan mencapai union dari tulang tersebut masih menjadi suatu tantangan tersendiri. Ekspresi faktor pertumbuhan seperti Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) dapat menstimulasi proses penyembuhan tulang. Calcium sulfate berguna sebagai biomaterial penghantar growth factor seperti VEGF. Pemberian VEGF dalam calcium sulfate dapat membantu proses regenerasi tulang melalui stimulasi proliferasi dan diferensiasi osteoblast serta sintesis kolagen tipe I yang dapat membantu regenerasi tulang yang mengalami defek. METODE. Penelitian eksperimental randomized post-test only control group design dengan sampel 32 ekor tikus Wistar jantan. Tikus kemudian dibagi menjadi 2 kelompok, dan diadaptasikan selama 1 minggu sebelum dilakukan pembuatan defek pada tulang femur tikus dan dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair. Kelompok pertama diberikan VEGF dalam bone graft calcium sulfate, kelompok kedua hanya pemberian bone graft calcium sulfate. Perawatan luka dilakukan setiap hari selama 1 minggu dan pada minggu keempat dilakukan pengambilan defek tulang untuk pemeriksaan ekspresi dari kolagen tipe I dan jumlah sel osteoblas. HASIL. Didapatkan jumlah rerata osteoblas pada tikus dengan pemberian VEGF dalam calcium sulfate (387,875 ± 17,587) lebih banyak dibandingkan pemberian calcium sulfate saja (284,937 ± 10,009), uji inferensial dengan independent t-test menunjukkan perbedaan yang signifikan dari jumlah sel osteoblas antara kedua kelompok, dimana p=0,000 (p < 0,05). Didapatkan ekspresi kolagen tipe I yang lebih tinggi pada pemberian VEGF dalam calcium sulfate dengan mean rank 24,50 dibanding pemberian calcium sulfate saja, dengan mean rank 8,50. Dan uji Mann- Whitney U didapatkan perbedaan yang signifikan dari ekspresi kolagen tipe I antara kedua kelompok dengan nilai p=0,000 (p < 0,05). KESIMPULAN. Pemberian VEGF dalam calcium sulfate pada defek pada tulang femur tikus setelah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair, memiliki jumlah osteoblast lebih banyak dan ekspresi kolagen tipe I lebih tinggi bila dibandingkan dengan pemberian calcium sulfate saja. Kata kunci: VEGF, calcium sulfate, defek tulang, osteoblas, kolagen tipe I, bone recycling, nitrogen cair ix

3 DAFTAR ISI LEMBAR PENGESAHAN... iii TESIS INI TELAH DIUJI PADA... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi DAFTAR ISI... x DAFTAR TABEL... xv DAFTAR SINGKATAN... xvi DAFTAR LAMPIRAN... xviii BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Masalah Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Tujuan umum Tujuan khusus Manfaat Penelitian Manfaat Akademik/Ilmiah Manfaat praktis... 5 BAB II KAJIAN PUSTAKA Anatomi Tulang... 6 x

4 2.1.2 Fisiologi dari pembentukan tulang Pembentukan tulang Osteoblas Matriks tulang Osifikasi Intramembranous (Mesenchymal) Proses Penyembuhan Tulang Remodelling tulang Mediator dari Remodelling Fase Remodelling Faktor regulator pada remodeling tulang Regulator lokal dari remodeling tulang Matriks Protein Sitokin Bone Recycling Pengertian cryosurgery Teknik cryosurgery Efek cryosurgery VEGF Bone Graft Hydroxyapatite Kolagen Fibril forming collagens Kolagen tipe I, II, III, V, dan XI Hubungan VEGF, Calcium Sulfat dalam Pembentukan Sel Osteoblas dan Matriks Osteoid xi

5 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS Kerangka Berpikir Kerangka Konsep Hipotesis BAB IV METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Penentuan Sumber Data Populasi Sampel Penelitian dan Cara Pengambilan Sampel Kriteria Eksklusi dan Drop out Besar Sampel Penelitian Variabel Penelitian Klasifikasi variabel Definisi Operasional Variabel Alat dan Bahan Penelitian Alat Penelitian Bahan Penelitian Cara Kerja Alur Penelitian Analisa Data BAB V HASIL PENELITIAN Analisis Sampel Analisis deskriptif xii

6 5.2 Analisis Inferensial Uji normalitas dan homogenitas Uji Independent T-Test Uji Mann-Whitney U BAB VI PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN Subjek Penelitian Hubungan VEGF dalam Calcium Sulfat dengan Sel Osteoblas Pada Defek Tulang Femur Tikus Setelah Dilakukan Bone Recycling dengan Nitrogen Cair Hubungan VEGF dalam Calcium Sulfat dengan Kolagen Tipe I pada Defek Tulang Femur Tikus Setelah Dilakukan Bone Recycling dengan Nitrogen Cair BAB VII SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA xiii

7 DAFTARGAMBAR Gambar 2.1 Siklus Sel dalam Cryosurgery Gambar 2.2 Diagram Diagram mekanisme cedera endotel karena pendinginan Gambar 2.3 Diagram Skematik Interaksi dari Beberapa Intracellular Signaling Pathways Gambar 3.1. Bagan Kerangka Berpikir Gambar 3.2. Bagan Kerangka Konsep Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian Gambar 4.2 Alur Penelitian xiv

8 DAFTAR TABEL Tabel 5.1 Distribusi frekuensi subjek penelitian masing-masing kelompok Tabel 5.2 Rerata jumlah osteoblas pada masing-masing kelompok Tabel 5.3 Persentase ekspresi Kolagen tipe I pada masing-masing kelompok Tabel 5.4 Uji normalitas data variable jumlah osteoblas dengan Shapiro-Wilk 77 Tabel 5.5 Uji Homogenitas varian data variabel-variabel penelitian dengan Levene s Test Tabel 5.6 Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok perlakuan dan kontrol.. 78 Tabel 5.7 Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok perlakuan dan kontrol. 79 xv

9 DAFTAR SINGKATAN BMP : bone morphogenic protein 2 Cox-2 CREB CS EGF FACIT FGF GCT GM-CSF HA : cyclo-oxygenase-2 : camp responsive element binding protein : calcium sulfate : epidermal growth factor : fibril associated collagens : fibroblast growth factor : giant cell tumor : granulocyte / macrophage colony stimulating factor : hydroxyapatite IGF -1 : insulin like growth factor 1 IL LEF MAPK M-CSF MSC NF-κB PDGF PG PKA PLC : interleukin : lymphoid enhancer factor : mitogen-activated protein kinase : macrophage- colony stimulating factor : mesenchymal stem cell : nuclear factor-κb : platelet- derived growth factor : prostaglandin : protein kinase-a : phospholipase-c xvi

10 PMN PTH TCF TGF- β TNF VEGF : polymorphonuclear neutrophils : paratiroid hormon : t-cell factor : transforming growth factor β : tumor necrosis factor : vascular endothelial growth factor xvii

11 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Keterangan Kelaikan Etik Lampiran 2. Surat Keterangan Selesai Melakukan Penelitian Lampiran 3. Surat Keterangan Hasil Pemeriksaan Histopatologi dan Imunohistokimia Lampiran 4. Data Analisis SPSS Lampiran 5. Dokumnetasi Penelitian xviii

12 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah Defek tulang dapat disebabkan oleh trauma, neoplasma, defek kongenital dan infeksi. Rekonstruksi defek tulang untuk mencapai panjang tulang yang ideal dan mencapai union dari tulang tersebut masih menjadi suatu tantangan tersendiri. Defek tulang ini dapat sembuh sendiri pada kondisi lingkungan yang sesuai, namun tetap meiliki tingkat non union tinggi akibat menurunnya vaskularisasi dan insufisiensi kalsium. Pada kasus neoplasma ganas, lesi osteolitik banyak ditemukan dan memerlukan tindakan rekonstruksi dengan megaprosthesis. Namun teknik ini secara ekonomis masih mahal dan beberapa tindakan yang dilakukan seperti kuretase pada neoplasma jinak agresif atau neoplasma ganas dapat menimbulkan defek tulang, sehingga salah satu teknik alternatif yang dapat digunakan adalah dengan teknik bone recycling. Teknik bone recycling dapat dilakukan dengan adjuvant lokal seperti nitrogen cair. Namun penggunaan nitrogen cair (cryosurgery) ternyata dapat menyebabkan ischemia pada tulang, nekrosis pada jaringan, dan kerusakan endothelium mikrovaskular yang dapat menimbulkan gangguan penyembuhan tulang (Costa et al. 2011). Untuk membantu proses penyembuhan pada defek tulang, maka diperlukan beberapa tindakan terapi seperti penggunaan graft tulang, bahan bone transport atau biomaterial untuk kepentingan rekonstruksi (Nandi et al. 2010). 1

13 2 Penggunaan prosedur graft tulang autolog saat ini merupakan standard dalam hal penggantian defek tulang. Graft ini dapat mengisi defek tulang dan menginduksi pembentukan jaringan tulang pada daerah defek karena memiliki sifat osteoinduktif, osteokonduktif dan osteogenik. Namun penggunaan graft autolog memiliki banyak keterbatasan terkait komplikasi yang terjadi pada tempat pengambilan graft. Penggunaan allograft saat ini dapat memperbaiki keterbatasan yang ada dari autolog graft (Munthe & Suroto 2014). Sampai saat ini, penggunaan graft autolog maupun allograft ternyata masih menimbulkan permasalahan terkait stabilitas biomekanik, serta kurangnya sifat osteogenisitas dan osteoinduksivitas sehingga diperlukan substansi tertentu seperti faktor pertumbuhan, seperti FGF, PDGF, TGF-β, dan BMP, untuk membantu meningkatkan osteogenisitas dan osteoinduksivitas graft tersebut (Barnes et al. 1999; Nandi et al. 2010). Ekspresi beberapa faktor pertumbuhan seperti FGF, PDGF, TGF-β, dan BMP telah menunjukkan stimulasi terhadap penyembuhan tulang, sedangkan peran langsung VEGF dalam penyembuhan tulang masih kurang jelas. Proses angiogenesis dengan osteogenesis dalam homeostasis tulang merupakan proses yang sinergis dan saling melengkapi untuk poses penyembuhan tulang, dan VEGF merupakan salah satu faktor pertumbuhan yang dapat membantu meningkatkan ekspresi BMP dan diferensiasi osteoblast sehingga proses penyembuhan tulang dapat berlangsung baik pada defek tulang tersebut (Zelzer & Olsen 2004; Yang et al. 2012). Untuk membantu proses penyembuhan tulang, pemberian VEGF memerlukan bahan pembawa, dimana salah satunya dapat digunakan calcium sulfate.

14 3 Calcium sulfate sebagai suatu material biokompatibel dapat membantu proses regenerasi defek tulang serta dapat digunakan sebagai biomaterial penghantar growth factor yang berguna dalam proses angiogenesis dengan osteogenesis dalam homeostasis tulang (Drosse et al. 2008; Thomas & Puleo 2009). Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan suatu penelitian untuk mengetahui efek growth factor seperti VEGF dalam biomaterial calcium sulfate terhadap proses penyembuhan defek tulang yang telah dilakukan bone recycling dengan nitogen cair. 1.2 Rumusan Masalah Dari latar belakang masalah yang diuraikan diatas, untuk membuktikan peran VEGF dalam Calsium Sulfate terhadap penyembuhan tulang pada defek tulang yang telah mengalami bone recycling dengan nitrogen cair, maka disusun rumusan masalah sebagai berikut: 1. Apakah pemberian VEGF dalam Calcium Sulfate pada defek tulang femur tikus yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair menginduksi sel osteoblast lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian VEGF? 2. Apakah pemberian VEGF dalam Calcium Sulfate pada defek tulang femur tikus yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair menginduksi ekspresi kolagen tipe I lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian VEGF?

15 4 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan umum Memperkuat teori penyembuhan pada defek tulang dengan penggunaan growth factor VEGF dan bone graft Calcium Sulfate dalam hal meningkatkan sel Osteoblas dan ekspresi Kolagen tipe I Tujuan khusus 1. Membuktikan pemberian VEGF dalam Calcium Sulfate pada defek tulang femur tikus yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair menginduksi sel osteoblast lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian VEGF. 2. Membuktikan pemberian VEGF dalam Calcium Sulfate pada defek tulang femur tikus yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair menginduksi ekspresi kolagen tipe I lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian VEGF. 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat Akademik/Ilmiah Apabila penelitian ini terbukti, diharapkan hasilnya dapat menambah ilmu pengetahuan teori tentang peran VEGF dalam graft Calcium Sulfate dapat menginduksi ekspresi kolagen tipe I lebih banyak pada defek tulang tikus yang telah dilakukan bone recycling dengan nitrogen cair. Disamping itu menambah pengetahuan bahwa VEGF sebagai suatu substansi angiogenik yang dapat

16 5 membantu menginduksi osteoinduksivitas dan osteogenisitas graft pada penyembuhan defek tulang Manfaat praktis Apabila penelitian ini terbukti dapat dipergunakan sebagai data penelitian lebih lanjut untuk menjadikan VEGF sebagai substansi untuk membantu kinerja graft dalam penyembuhan defek tulang.