VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF ULTRAVIOLET UNTUK PENENTUAN RESERPIN DALAM TABLET OBAT NIKEN WULANDARI

Transkripsi

1 VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF ULTRAVIOLET UNTUK PENENTUAN RESERPIN DALAM TABLET OBAT NIKEN WULANDARI DEPATEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 007

2 PENDAHULUAN Pengawasan produk obat harus dilakukan untuk menjamin mutu dan keamanannya. Salah satu jenis pengawasan mutu tersebut adalah analisis kadar senyawa aktif dalam proses pengendalian mutu obat. Penentuan kadar senyawa aktif memerlukan suatu metode analisis dengan ketelitian dan ketepatan yang cukup baik. Selain itu juga memenuhi kriteria lain seperti spesifisitas, linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan (robustness). Metode spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV) telah dikembangkan oleh Rachmanti (006) untuk penentuan kadar reserpin dalam tablet obat hipertensi yang mengandung reserpin. Teknik ini dapat menjadi alternatif dalam pengawasan mutu produk obat hipertensi dengan senyawa aktif reserpin karena berbagai keuntungan yang dimilikinya seperti cepat, mudah, murah, dan tanpa adanya tahap pemisahan. Metode analisis penentuan reserpin dapat digunakan untuk analisis rutin jika telah tervalidasi. Validasi metode analisis adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan (Harmita 004). Proses ini bukan suatu proses tunggal, namun merupakan salah satu bagian dari prosedur analisis yang tidak dapat dipisahkan (Ermer & Miller 005). Validasi metode dilakukan untuk metode yang baru dikembangkan, atau jika metode tersebut akan digunakan untuk kegiatan yang bersifat rutin, jika terjadi perubahan antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode, dan jika terjadi perubahan metode dari metode standar. Penentuan kadar reserpin dengan SDUV merupakan suatu metode baru yang dikembangkan untuk contoh tablet obat dengan matriks yang kompleks. Validasi metode SDUV dapat digunakan untuk mengetahui keabsahan data yang dihasilkan. Menurut ICH (1995), metode analisis dapat memberikan data yang dipercaya jika memenuhi beberapa parameter yang telah disyaratkan, yaitu spesifisitas, ketelitian (presisi), ketepatan (akurasi), linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Untuk penentuan kadar senyawa aktif dalam produk obat, parameter ketangguhan tidak perlu ditentukan, sedangkan parameter yang akan ditentukan dalam penelitian ini hanya meliputi linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan data yang dihasilkan dari metode SDUV untuk penentuan kadar reserpin dalam tablet obat Serpasil. TINJAUAN PUSTAKA Reserpin Reserpin (C 33 H 40 N O 9 ) (Gambar 1) merupakan salah satu jenis alkaloid indol yang digunakan untuk pengobatan penyakit hipertensi, menurunkan denyut jantung, terapi bagi penderita skizofrenia, dan obat penenang (Forney 007). Reserpin dapat diperoleh dari ekstrak tumbuhan genus Rauwolfia, terutama spesies R. serpentina dan R. vomitoria. Sumber lain dari obat ini adalah berbagai spesies tanaman dari genus Alstonia, Excatavia, Ochrosia, Tanduzia, Vallesia, dan Vinca (Apocynaceae), namun kadarnya sangat rendah (Hesse 00). H 3 C O H N H 3 C O H O H N O CH 3 O O H CH 3 O O CH 3 O CH3 Gambar 1 Struktur reserpin (C 33 H 40 N O 9 ). Beberapa sifat fisik dan kimia dari reserpin adalah berwujud padatan (bubuk kristal) yang berwarna putih, tidak berbau dan menjadi berwarna kehitaman jika dibiarkan di udara terbuka. Reserpin tidak larut dalam air dan eter, sukar larut dalam etanol dingin, serta larut dalam kloroform dan asam asetat. (British Pharmacopoeia 1993). Metode penentuan kadar reserpin dalam tablet obat yang telah lazim dilakukan adalah spektrofotometri sinar tampak (British Pharmacopoeia 1993, Singh et al. 004, AOAC 005), spektrofluorometri (AOAC 005), dan kromatografi cair kinerja tinggi (USP 006). Metode-metode tersebut dapat menghasilkan data yang akurat, namun mempunyai beberapa kekurangan, misalnya untuk kromatografi cair kinerja tinggi biayanya sangat mahal dan metode spektrofotometri tidak dapat digunakan untuk contoh dengan matriks yang kompleks.

3 Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet (SDUV) Teknik SDUV telah diperkenalkan pada tahun 1953 (Popovic et al. 000) dan mengalami perkembangan cukup pesat selama 5 tahun terakhir serta digunakan secara luas sebagai alat untuk analisis kuantitatif, pencirian, dan kendali mutu di bidang pertanian, farmasi, dan biomedis (Kazemipour et al. 00). Metode SDUV merupakan metode paling umum untuk penentuan secara serentak campuran biner suatu senyawa dengan spektrum yang bertumpang tindih (El Sayed & El Salem 004). Metode SDUV didasarkan pada spektrum turunan (derivatif) ke-n yang diperoleh dari spektrum serapan normal UV-Vis (ultraviolet dan sinar tampak) atau spektrum turunan ke-0 (Karpinska 004). Spektrum derivatif diperoleh dengan menggunakan persamaan matematika. Keuntungan dari cara ini adalah spektrum derivatif dapat dihitung dengan parameter yang berbeda dan teknik penghalusan dapat digunakan untuk meningkatkan nisbah sinyal terhadap derau (noise) (Ojeda & Rojas 004). Menurut O Haver (1979), spektrofotometri derivatif merupakan pengukuran kemiringan garis spektrum, yaitu rerata perubahan absorbans terhadap panjang gelombang. Spektrofotometri derivatif tetap mempertahankan semua hukum (persamaan) spektrofotometri konvensional (Karpinska 004). Hukum Beer pada spektrum normal, A εbc, pada bentuk derivatif akan menjadi n d A d ε D n bc n n dλ dλ dengan D n adalah turunan orde ke-n pada panjang gelombang λ. Spektrum normal diperoleh dari plot hubungan antara nilai absorbans (A) dan nilai panjang gelombang (λ), sedangkan spektrum turunan pertama merupakan plot hubungan antara da/dλ dan nilai λ, nilai plot spektrum turunan pertama digunakan untuk menentukan d A/dλ yang apabila diplot terhadap λ maka akan menghasilkan plot spektrum turunan kedua. Untuk memperoleh spektrum turunan ke-n maka dibuat plot hubungan antara d n A/dλ n dan nilai λ (Gambar ) (Skujins 1986). Penerapan hukum Lambert-Beer ini berdasarkan pada pemilihan kondisi optimum, termasuk pemilihan pita spektrum yang paling sesuai, orde derivatif yang cocok, serta metode pengukuran dan optimalisasi semua parameter instrumen yang penting (Popovic et al. 000). n Gambar Spektrum serapan normal dan turunannya (O Haver 1979). Analisis kuantitatif pada metode SDUV dilakukan dengan cara mengukur amplitudo spektrum derivatif. Jika konsentrasi contoh pada spektrum normal sebanding dengan absorbans, maka konsentrasi contoh pada spektrum derivatif sebanding dengan amplitudo. Metode pengukuran amplitudo ada beberapa cara, yaitu dari puncak ke puncak (p 1, p ), puncak ke garis dasar (z), dan puncak tangen (t) (Gambar 3) (Popovic et al. 000). Gambar 3 Pengukuran amplitudo pada spek-trum derivatif (Popovic et al. 000). λ (nm) Teknik SDUV mempunyai beberapa keuntungan yang tidak dapat diperoleh dari teknik Ampliyudo Absorbans Amplitudo Amplitudo Spektrum normal Spektrum turunan ke-1 Spektrum turunan ke- Panjang gelombang (nm) lain. Beberapa di antaranya adalah mempercepat waktu analisis, mengurangi biaya yang dibutuhkan dan dapat digunakan untuk pemisahan senyawa campuran dengan spektrum yang bertumpang tindih tanpa membutuhkan tahap pemisahan analit dari matriksnya (Karpinska 004). Selain itu, pergeseran garis dasar dapat dihilangkan dan efek kekeruhan dapat dikurangi (O Haver 1979), meningkatkan selektivitas dan sensitivitas analisis komponen minor, meningkatkan resolusi spektrum, serta dapat menentukan

4 serapan maksimum secara tepat (Popovic et al. 000). 3

5 4 Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan (Harmita 004). Suatu metode yang baru dikembangkan untuk kegiatan rutin harus divalidasi sebelum digunakan. Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode, atau terjadi perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapatulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi risiko penyimpangan yang mungkin timbul. Terdapat beberapa rujukan validasi metode seperti United State Pharmacopoeia (USP), British Pharmacopoeia (BP), Association of Official Analytical Chemists (AOAC), International Conference on Harmonization (ICH), dan International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Penelitian ini mengacu pada petunjuk validasi metode dari ICH (1995) yang dikhususkan untuk analisis obat-obatan. Menurut ICH (1995), prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian, yaitu identifikasi suatu senyawa tertentu, kuantitasi adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu, terdapat 8 parameter validasi metode analisis, yaitu spesifisitas, ketelitian, ketepatan, linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan, sedangkan parameter yang harus dipenuhi untuk validasi metode analisis produk obat-obatan meliputi spesifisitas, linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Linearitas Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu (ICH 1995). Hal ini dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya. Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat terkecil, yaitu y a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari (ICH 1995 diacu dalam Chan 004). Linearitas juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 005). Residual menyatakan besarnya penyimpangan yang terjadi antara nilai yang terukur (y) dan nilai teoretis yang dihitung dari persamaan regresi (ŷ). Plot antara residual dan konsentrasi dibuat untuk mengetahui distribusi residual secara statistik. Jika residual terdistribusi secara normal (rerata mendekati nol dan berbentuk linear), maka persamaan regresi dapat dikatakan mempunyai bentuk yang benar. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Limit deteksi (LD) merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam contoh yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi (LK) adalah jumlah analit terkecil dalam contoh yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk menentukan adanya pengotor atau degradasi produk (ICH 1995). Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh. Ketelitian Ketelitian prosedur analisis menyatakan kedekatan hasil dari sederet pengukuran yang diperoleh dari contoh yang homogen pada kondisi tertentu (ICH 1995). Ketelitian dinyatakan dengan 3 cara, yaitu keterulangan (repeatability), ketelitian intermediet (intermediet precision), dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah pengukuran ketelitian dengan metode, peralatan, dan laboratorium yang sama pada selang waktu tertentu. Ketelitian intermediet dilakukan dalam laboratorium yang sama, namun dengan operator dan peralatan yang berbeda serta pada hari yang berlainan. Ketertiruan merupakan pengukuran ketelitian yang dilakukan dengan peralatan, operator, dan laboratorium yang berbeda.

6 5 Pengujian ketelitian dinyatakan dengan simpangan baku relatif (SBR). Menurut ICH (1995), kriteria nilai SBR yang dapat diterima adalah kurang dari %. Ketepatan Ketepatan suatu metode analisis didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun sebagai nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran (ICH 1995 diacu dalam Chan 004). Ketepatan dinyatakan sebagai perolehan kembali yang ditentukan dengan cara menambahkan sejumlah tertentu standar dari analit yang akan diukur ke dalam contoh. Perolehan kembali (%) yang dapat diterima menurut ICH adalah 98 10%. ICH juga mensyaratkan minimum 9 kali pengukuran pada 3 tingkat konsentrasi yang berbeda. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tablet obat Serpasil, standar reserpin, etanol absolut, larutan H SO M, larutan natrium nitrit 0.3% (b/v), dan larutan asam sulfamat 5% (b/v). Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis 800 Hitachi beserta kuvet 1 cm, neraca analitik, seperangkat komputer, peranti lunak UV Solutions versi.0 dan Microsoft Excel tahun 003, pemanas, dan alat-alat kaca. Pengukuran Konsentrasi Reserpin dengan Metode SDUV Parameter validasi metode SDUV yang ditentukan meliputi linearitas, ketepatan, ketelitian, limit deteksi, dan limit kuantitasi. Penentuan kadar reserpin dilakukan pada kondisi optimum yang telah ditentukan pada penelitian sebelumnya (Rahmanti 006). Kadar reserpin yang diperoleh dengan metode SDUV dibandingkan dengan metode rujukan British Pharmacopoeia (1993) (Lampiran 1). Pembuatan Larutan Standar dan Contoh Sebanyak 10 mg serbuk reserpin dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambahkan 0 ml etanol absolut hangat kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik selama 0 menit. Larutan ini dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan dengan etanol. Larutan stok standar dengan konsentrasi 100 μg/l diencerkan menjadi 10, 0, 30, 40, dan 50 μg/ml. Tablet obat sebanyak 0.5 g dihaluskan dan dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 0 ml etanol absolut hangat dan dipanaskan pada suhu 50 ºC sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 0 menit. Larutan ini dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditepatkan dengan etanol. Pengukuran Larutan Standar dan Contoh Pengukuran larutan standar dan contoh dilakukan pada kondisi optimum yang telah ditentukan oleh Rachmanti (006). Larutan standar dan contoh diukur serapannya dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang nm dengan kecepatan pemayaran 00 nm/menit. Spektrum yang diperoleh kemudian diolah dengan perangkat lunak UV Solutions pada kondisi optimum sebagai berikut: orde turunan 1, orde penghalusan, jumlah jendela 17, dan amplitudo diukur dari puncak spektrum ke garis dasar (z) pada panjang gelombang 77.4 nm. Validasi Metode SDUV Linearitas Sebanyak 5 larutan standar disiapkan dengan konsentrasi 10, 0, 30, 40, 50 μg/ml. Masing-masing konsentrasi dibuat sebanyak 6 ulangan kemudian setiap larutan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada kondisi optimum dan dibuat persamaan garisnya dengan metode regresi linear (y a + bx). Peubah a menyatakan intersep dan b adalah kemiringan garis dari kelima larutan standar yang diukur. Linearitas kurva kalibrasi dilihat dari nilai koefisien korelasi (r). Limit Deteksi (LD) dan Limit Kuantitasi (LK) Persamaan linear yang diperoleh pada uji linearitas selanjutnya digunakan untuk menghitung limit deteksi dan limit kuantitasi. LD dan LK dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh dengan rumus sebagai berikut: LD 3.3 b Sa dengan: LD limit deteksi (μg/ml) LK limit kuantitasi (μg/ml) LK 10 b Sa

7 6 Sa simpangan baku intersep kurva standar (n 6) b rerata kemiringan garis kurva standar Ketelitian Larutan contoh yang telah disiapkan sesuai dengan prosedur di atas kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis sebanyak 6 ulangan pada hari yang sama (intraday) dan pada hari yang berlainan (interday) selama 5 hari berturut-turut. Ketelitian diukur dengan menghitung persentase simpangan baku relatif (%SBR) data dengan menggunakan rumus s ( x) n i 1 x i n 1 s SBR (%) 100% x Keterangan: s simpangan baku SBR simpangan baku relatif x i kadar reserpin tiap ulangan x rerata kadar reserpin n jumlah ulangan Ketepatan Larutan standar reserpin disiapkan dengan konsentrasi 100 μg/ml dan larutan stok contoh dibuat dengan konsentrasi 50 μg/ml. Sebanyak 10 ml contoh dipindahkan ke dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan larutan standar reserpin masing-masing sebanyak 10, 15, dan 17.5 ml kemudian volumenya ditepatkan dengan etanol. Masing-masing larutan dibuat 3 ulangan. Perolehan kembali dihitung dengan rumus a b Perolehan kembali (%) 100% c dengan: a konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang terukur b konsentrasi contoh c konsentrasi standar teoretis yang ditambahkan Pengukuran Reserpin dengan Metode British Pharmacopoeia (1993) Serbuk obat sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 1 ml etanol, 1 ml H SO M, dan ditambahkan 5 ml etanol. Larutan ini dihangatkan agar contoh obat mudah larut. Larutan didinginkan dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditera dengan etanol. Larutan ini disebut larutan A. Larutan A sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan ml H SO M dan ml larutan natrium nitrit 0.3% (b/v) segar. Campuran dipanaskan pada suhu 55 ºC selama 35 menit pada penangas air kemudian didinginkan. Larutan asam sulfamat 5% (b/v) sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam larutan contoh kemudian larutan contoh dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditera dengan etanol. Larutan dibuat sebanyak 6 ulangan dan absorbans diukur pada λ 389 nm menggunakan sel rujukan yang berisi 10 ml larutan A tanpa penambahan natrium nitrit. HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Optimum Metode SDUV Penentuan reserpin dalam tablet obat Serpasil dengan metode SDUV dilakukan pada kondisi optimum yang telah ditentukan oleh Rahmanti (006). Reserpin dalam obat dapat ditentukan dengan metode SDUV karena bentuk spektrum contoh dengan standar reserpin saling berimpit (bentuknya sama). Spektrum serapan normal (turunan ke- 0) dibuat pada panjang gelombang nm, yaitu daerah panjang gelombang sinar UV. Spektrum dibuat dengan kecepatan pemayaran 00 nm/menit sehingga spektrum yang diperoleh tetap akurat setelah diturunkan. Spektrum yang diperoleh kemudian diolah dengan peranti lunak UV Solutions. Orde turunan yang digunakan adalah 1, yaitu hubungan antara da/dλ dan nilai λ. Jika orde turunan terlalu tinggi, nisbah sinyal terhadap derau akan menurun. Namun, hal ini dapat diatasi dengan proses penghalusan menggunakan teknik Savitzky-Golay yang meliputi orde penghalusan dan jumlah jendela. Orde penghalusan yang dipilih adalah dengan jumlah jendela 17. Orde penghalusan yang semakin tinggi menyebabkan amplitudo semakin besar sementara jumlah jendela yang digunakan semakin banyak menyebabkan amplitudo semakin kecil. Gambar 4 menunjukkan spektrum serapan standar reserpin dan contoh pada kondisi optimum.

8 7 Amplitudo Panjang gelombang (nm) Gambar 4 Spektrum serapan reserpin pada kondisi optimum. Keterangan: Cokelat standar reserpin 10 μg/ml Biru tua standar reserpin 0 μg/ml Hijau standar reserpin 30 μg/ml Biru standar reserpin 40 μg/ml Hitam standar reserpin 50 μg/ml Merah contoh obat Linearitas Linearitas metode SDUV ditentukan dengan cara membuat kurva hubungan antara amplitudo spektrum derivatif pada sumbu y dan konsentrasi standar pada sumbu x. Konsentrasi yang digunakan berkisar μg/ml. Pengujian parameter ini dilakukan sebanyak 6 ulangan. Tabel 1 menyajikan persamaan regresi linear dari masing-masing kurva standar (Lampiran ) dan kurva standar rerata. Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh koefisien korelasi dari 6 ulangan berkisar , dan untuk kurva standar rerata sebesar Menurut ICH (1995 diacu dalam Chan 004), nilai ini memenuhi syarat yang ditetapkan, yaitu Nilai koefisien korelasi yang tinggi menunjukkan hubungan yang linear antara sinyal detektor yang terukur dan jumlah reserpin dalam contoh. Tabel 1 Koefisien korelasi dan persamaan regresi linear kurva standar (n 6) No. Persamaan Regresi Linear r 1 y (1.38x +.58) y (1.41x +.96) y (1.36x +.70) y (1.46x ) y (1.44x +.95) y (1.45x +.71) Rerata y (1.4x +.94) Persamaan regresi linear untuk kurva standar rerata adalah y (1.4x +.94) 10-4 (Gambar 5). Nilai intersep (a) dan batas galatnya (tsa) pada selang kepercayaan 95% sebesar ± (Tabel ). Nilai intersep menyatakan adanya pengaruh matriks pada larutan. Nilai intersep yang semakin jauh dari nol dipengaruhi oleh matriks dalam larutan yang semakin besar. Hal ini dapat mengganggu penentuan analit dalam contoh yang akan ditentukan. Persamaan regresi kurva standar rerata mempunyai intersep yang tidak jauh dari nol, yaitu ± sehingga matriks contoh tidak terlalu mengganggu penentuan kadar reserpin. Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) Gambar 5 Kurva standar rerata reserpin pada konsentrasi μg/ml. Nilai kemiringan garis menyatakan sensitivitas suatu metode. Nilai kemiringan garis yang kecil menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang kecil tidak terlalu berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan, sehingga metode mempunyai sensitivitas yang kurang baik. Nilai kemiringan garis (b) dan batas galatnya (tsb) adalah ± (Tabel ). Nilai ini cukup besar sehingga perubahan konsentrasi yang kecil akan berpengaruh terhadap perubahan sinyal detektor. Contoh perhitungan parameter statistika disajikan pada Lampiran 3. Tabel Parameter statistika kurva standar rerata (n 6) Parameter statistika Metode SDUV Persamaan regresi linear y (1.4x +.94) 10-4 Intersep (a) Sa tsa Kemiringan garis (b) Sb tsb Koefisien korelasi (r)

9 8 Persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi metode mempunyai residual yang terdistribusi secara normal, sehingga dapat dikatakan bahwa penyimpangan yang terjadi tidak terlalu besar. Hal ini menunjukkan bahwa persamaan regresi dapat digunakan untuk menentukan kadar reserpin dalam contoh. Plot antara residual dan konsentrasi standar reserpin dapat dilihat pada Gambar 6. Residual [Reserpin] (ppm) Gambar 6 Hubungan antara konsentrasi reserpin dan residual kurva standar rerata. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Limit deteksi (LD) dan limit kuantitasi (LK) ditentukan dari persamaan regresi linear kurva standar rerata hasil penentuan linearitas. Parameter ini ditentukan untuk mengetahui konsentrasi terendah pada saat sinyal antara blangko dan analit dapat dibedakan. Kedua parameter ini mempunyai nilai yang berbeda bergantung pada metode yang digunakan, walaupun menggunakan instrumen yang sama. Limit deteksi metode SDUV untuk penentuan reserpin dalam tablet obat sebesar μg/ml. Nilai ini menunjukkan bahwa sinyal antara reserpin dan blangko dapat dibedakan pada konsentrasi terendah μg/ml. Instrumen tidak dapat membedakan sinyal antara blangko dan reserpin pada konsentrasi di bawah nilai ini. Limit kuantitasi ditentukan untuk mengetahui konsentrasi terendah yang dapat ditentukan oleh suatu metode pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. Nilai limit kuantitasi berdasarkan hasil penelitian adalah.1690 μg/ml. Konsentrasi analit yang terukur di bawah nilai ini memberikan ketelitian dan ketepatan yang tidak baik. Perhitungan limit deteksi dan limit kuantitasi tertera pada Lampiran 4. Ketelitian Ketelitian metode SDUV ditentukan sebanyak 6 ulangan, baik intraday maupun interday. Ketelitian yang ditentukan adalah keterulangan karena dilakukan oleh operator, instrumen, peralatan, dan laboratorium yang sama. Keterulangan dilakukan untuk mengetahui adanya galat acak yang berasal dari penyiapan larutan maupun instrumen. Keterulangan intraday dapat digunakan untuk mengetahui adanya galat acak yang berasal dari penyiapan larutan, seperti penimbangan, pembuatan larutan, dan penyaringan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa SBR intraday untuk masing-masing hari bernilai kurang dari % (Tabel 3) dengan kadar reserpin rerata dalam 1 tablet obat untuk hari ke-1 hingga hari ke-5 secara berturut-turut adalah 0.68; 0.565; 0.580; 0.631; dan mg. Nilai SBR di bawah % menunjukkan bahwa galat acak yang berasal dari penyiapan larutan tidak memengaruhi hasil analisis secara nyata. Data dan perhitungan ketelitian untuk hari ke-1 hingga hari ke-5 ditunjukkan pada Lampiran 5. Tabel 3 Simpangan baku relatif (%SBR) untuk intraday maupun interday Hari ke- Reserpin (mg) SBR (%) Rerata Keterulangan interday dilakukan selama 5 hari berturut-turut. Hal ini dilakukan untuk mengetahui adanya galat acak yang berasal dari instrumen dan kondisi laboratorium pada hari yang berlainan. Nilai SBR untuk keterulangan interday adalah 1.61% dengan kadar reserpin rerata ± mg per tablet obat (Lampiran 6), sehingga dapat dikatakan bahwa galat acak yang berasal dari instrumen dan kondisi laboratorium yang berbeda tidak memengaruhi hasil analisis. Oleh sebab itu, metode SDUV mempunyai keterulangan intraday dan interday yang baik. Ketepatan Ketepatan metode SDUV ditentukan dengan metode penambahan standar dan dinyatakan dengan perolehan kembali (%). Perolehan kembali merupakan jumlah standar yang dapat diperoleh kembali setelah ditambahkan ke dalam contoh. Ketepatan

10 9 dapat menunjukkan adanya galat sistematik yang dapat memengaruhi metode analisis. Galat sistematik dapat menyebabkan hasil analisis menjadi lebih besar atau lebih kecil. Beberapa contoh penyebab galat sistematik di antaranya adalah galat pada saat pengambilan contoh, kurva kalibrasi yang tidak linear, serta galat yang disebabkan oleh instrumen dan peralatan kaca yang digunakan (Harvey 000). Penentuan ketepatan dilakukan dengan menambahkan standar reserpin sebanyak 1.00, 1.5, dan 1.75 mg ke dalam contoh obat yang telah berisi 0.5 mg reserpin. Perolehan kembali yang diperoleh berkisar antara dan % (Tabel 4). Menurut ICH (1995 diacu dalam Chan 004), nilai ini berada di luar batas nilai yang diterima, yaitu 98 10%. Namun, menurut AOAC (1993), nilai ini berada pada kisaran yang dapat diterima, yaitu %, sehingga dapat dikatakan metode ini mempunyai ketepatan yang cukup baik. Perhitungan perolehan kembali ditunjukkan pada Lampiran 7. Tabel 4 Perolehan kembali rerata metode SDUV Standar Reserpin (mg) Perolehan Ditambahkan Ditemukan kembali (%) Pengukuran Kadar Reserpin dengan Metode British Pharmacopoeia (1993) Metode British Pharmacopoeia (1993) digunakan sebagai metode rujukan untuk menentukan kadar reserpin dalam tablet obat. Metode ini menggunakan teknik spektrofotometri UV-Vis konvensional, yaitu pengukuran absorbans contoh pada panjang gelombang tertentu. Pengukuran dimulai dengan membuat kurva standar pada konsentrasi μg/ml. Persamaan regresi kurva standar yang diperoleh adalah y x dengan nilai r (Gambar 7). Kadar reserpin rerata dalam obat dengan menggunakan metode ini adalah mg dengan batas galat (selang kepercayaan 95%) mg. Perhitungan penentuan kadar reserpin dengan metode ini dapat dilihat pada Lampiran Absorbans 0 y x r [Reserpin] (ppm) Gambar 7 Persamaan regresi linear standar reserpin menggunakan metode British Pharmacopoeia (1993). Perbandingan Metode SDUV dan British Pharmacopoeia (1993) Kadar reserpin hasil penentuan dengan metode SDUV selanjutnya dibandingkan dengan metode rujukan. Hal ini dilakukan dengan cara melakukan uji statistika yang meliputi uji F dan uji t. Uji F dilakukan untuk membandingkan keragaman kedua metode. Kedua metode mempunyai keragaman yang tidak berbeda nyata karena F hitung < F tabel pada selang kepercayaan 95% (Tabel 5). Uji t digunakan untuk membandingkan efektivitas dan efisiensi metode baik dari segi teoretis maupun dari segi teknis (biaya). Nilai t hitung kedua metode lebih besar jika dibandingkan dengan nilai t tabel pada selang kepercayaan 95% (Tabel 5), sehingga kedua metode memberikan hasil yang berbeda nyata. Metode SDUV menghasilkan nilai yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan metode British Pharmacopoeia (1993). Tabel 5 Uji statistika metode SDUV dan British Pharmacopoeia (1993) Parameter statistika Metode SDUV Metode BP 1993 Kurva standar y(1.4x +.94) 10-4 y x r Kadar reserpin mg mg Batas galat F hitung F tabel t hitung t tabel.60

11 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pengujian parameter validasi menunjukkan bahwa metode SDUV mempunyai keabsahan data yang kurang baik. Metode ini mempunyai linearitas yang baik dengan r , limit deteksi dan limit kuantifikasi berturut-turut adalah dan.1690 μg/ml, ketelitian yang baik dengan nilai SBR di bawah %, namun mempunyai ketepatan yang kurang baik dengan perolehan kembali berkisar %. Uji statistika antara metode SDUV dan metode British Pharmacopoeia (1993) memperlihatkan keragaman yang sama (uji F) namun memberikan hasil yang berbeda nyata (uji t). Saran Perlu dilakukan penentuan ketidakpastian pengukuran dan sumber galat yang dapat mempengaruhi metode SDUV. Selain itu perlu digunakan metode pembanding yang lain seperti kromatografi cair kinerja tinggi dan metode lain untuk penentuan parameter ketepatan. DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemists AOAC Peer Verified Methods Program. Arlington: AOAC Inter national. [AOAC] Association of Official Analytical Chemistry Official Methods of Analysis of AOAC International. Ed ke-18. Maryland: AOAC International. British Pharmacopoeia British Pharmacopoeia Department of Health & Social Services for Northern Ireland. London: British Pharmacopoeia. Chan CC Potency Method Validation. Di dalam: Chan CC, Lee YC, Lam H, Zhang XM, editor. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. New Jersey: John Wiley & Sons. El-Sayed AAY, El-Salem NA Recent development of derivative spectrophotometry and their analytical applications [ulasan]. Anal Sci 1: Ermer J, Miller JH, editor Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Weinheim: Wiley-VCH. Forney B Reserpine For Veterinary Use. [terhubung berkala] woodpharmacy.com [9 Jan 007]. Harmita Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan perhitungannya. Maj Ilmu Kefarmasian, 1(3): Harvey D Modern Analytical Chemistry: McGraw-Hill. Hesse M. 00. Alkaloids, Nature s Curse or Blessing. Weinheim: Wiley-VCH. [ICH] International Conference on Harmonization Validation of Analytical Prosedures: Methodology QB [terhubung berkala]. [19 Des 006] [ICH] International Conference on Harmonization Validation of Analytical Prosedures: Text and Methodology Q (R1) [terhubung berkala]. [19 Des 006] Karpinska J Derivative spectrophotometry recent applications and directions of development [ulasan]. Talanta 64: Kazemipour M, Noroozian E, Tehrani MS, Mahmoudian M. 00. A new secondderivative spectrophotometry methods for the determination of permenthrin in shampoo. J Pharm Biomed Anal 30: Lewis RJ. 00. Hazardous Chemicals. Ed ke- 5. New York: A John Willey & Sons. O Haver TC Potential clinical applications of derivative and wavelength modulation spectrometry. Clin Chem 5: Ojeda CB, Rojas FS Recent development in derivative ultraviolet/visible absorption spectrophotometry [ulasan]. Anal Chim Acta 518:1-4 Popovic GV, Pfendt LB, Stefanovic VM Analytical application of derivative spectro-photometry. J Serb Chem Soc 65:457-47

12 11 Rachmanti WD Metode cepat untuk kuantitasi reserpin dalam obat dan ekstrak Rauwolfia serpentina secara spektrofotometri derivatif ultraviolet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Singh DK, Srivastava B, Sahu A Spectrophotometry determination of Rauwolfia alkaloids: Estimation of reserpine in pharmaceuticals. Anal Sci 0: Skujins S Application of UV-Visible Derivative Spectrophotometry. Steinhausertasse: Varian AG. [USP] United States Pharmacopoeia USP/NF. Maryland: USP Convention.

13 LAMPIRAN 1

14 13 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Standar Reserpin dan Contoh obat Metode Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet Metode Rujukan British Pharmacopoeia (1993) Penyiapan standar dan contoh Pengukuran larutan standar dan contoh pada kondisi optimum Valisasi Metode SDUV (Penentuan ketelitian, ketepatan, linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitasi) Uji statistika

15 14 Lampiran Persamaan regresi linear kurva standar reserpin ulangan ke 1 (a), (b), 3 (c), 4 (d), 5 (e), 6 (f) Amplitudo y x r (a) [Reserpin] (ppm) Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) (b) Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) (c) Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) (d) Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) (e) Amplitudo y x r [Reserpin] (ppm) (f)

16 15 Lampiran 3 Parameter statistika kurva standar rerata metode SDUV x i (x i - x ) x i y i ŷ i (y i - ŷ i ) x x x x10-10 Keterangan: x i konsentrasi standar; y i amplitudo yang terukur; ŷ i amplitudo teoritis Persamaan regresi linear rerata: y (1.4x +.94) 10-4 Σ x i 5500 Σ (y i - ŷ i ) Σ (x i - x ) 1000 Simpangan baku regresi (S r ) Simpangan baku intersep (Sa) S r n ) ( y ) i 1 i y i n x i i n (x x) i i Simpangan baku kemiringan (Sb) S r (x x) i i Selang kepercayaan intersep untuk α 0.05 dan derajat bebas 7 (t tabel.36) yaitu a ± tsa ± (.36)( ) ± Selang kepercayaan kemiringan garis untuk α 0.05 dan derajat bebas 7 (t tabel.36) yaitu b ± tsb ± (.36)( ) ±

17 16 Lampiran 4 Penentuan limit deteksi dan limit kuantitasi metode SDUV LD 3,3 b Sa LK 10 b Sa x 3.08 x x 3.08 x μg/ml.1690 μg/ml Keterangan: LD limit deteksi (μg/ml) LK limit kuantitasi (μg/ml) Sa simpangan baku intersep kurva standar (n 6) b rerata kemiringan garis kurva standar

18 17 Lampiran 5 Penentuan ketelitian intraday metode SDUV hari ke-1 hingga hari ke-5 Hari ke-1 Ulangan Bobot Obat (g) Amplitudo Kadar dalam Kadar dalam 5 ml (μg/ml) 1 tablet (mg) x 0.68 s SBR 1.3% Batas galat (95%) Bobot 5 obat g Contoh perhitungan ulangan 1: y (1.4x +.94) (1.4x +.94) 10-4 x μg/ml Kadar reserpin dalam 5 tablet obat kadar dalam 0.5 g obat volume larutan bobot 5 tablet bobot 0.5 g obat ppm 0.05 l g mg g Kadar reserpin dalam 1 tablet kadar reserpin dalam 5 tablet 5 Simpangan baku ( x) n i 1 x i n mg 0.68 mg mg s Simpangan baku relatif (%) 100% x mg 100% 1.3% 0.68 mg Batas galat t s n mg mg 6

19 18 lanjutan Lampiran 5 Hari ke- Ulangan Bobot Obat (g) Amplitudo Kadar dalam Kadar dalam 5 ml (μg/ml) 1 tablet (mg) x s SBR 0.89% Batas galat (95%) Hari ke-3 Ulangan Bobot Obat Kadar dalam Kadar dalam Amplitudo (g) 5 ml (μg/ml) 1 tablet (mg) x s SBR 1.10% Batas galat (95%) Hari ke-4 Ulangan Bobot Obat (g) Amplitudo Kadar dalam 5 ml (μg/ml) Kadar dalam 1 tablet (mg) x s SBR 1.04% Batas galat (95%) 0.009

20 19 lanjutan Lampiran 5 Hari ke-5 Ulangan Bobot Obat (g) Amplitudo Kadar dalam Kadar dalam 5 ml (μg/ml) 1 tablet (mg) x s 0.00 SBR 0.85% Batas galat (95%) Lampiran 6 Penentuan ketelitian interday metode SDUV Hari Kadar reserpin tiap tablet (mg) SBR (%) % % % % % x s SBR 1.61% Batas galat 0.005

21 0 Lampiran 7 Penentuan perolehan kembali metode SDUV Standar Reserpin (mg) Perolehan Ditambahkan Terukur kembali (%) Rerata (%) Batas Galat SBR (%) Contoh perhitungan untuk jumlah standar yang ditambahkan 1.00 mg (ulangan 1): a b Perolehan kembali (%) 100% c ( ) mg 100% mg % Keterangan: a konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang terukur b konsentrasi contoh c konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan Simpangan baku (SB) ( x) n i 1 x i n mg Simpangan baku relatif (%) SB 100% x 0.71 mg mg 100% 0.66% Batas galat t SB n mg 1.77 mg 3

22 1 Lampiran 8 Penentuam kadar reserpin dengan metode British Pharmacopoeia (1993) Serapan standar reserpin pada λ 389 nm [Standar Reserpin] Absorbans (μg/ml) Absorbans y x r [Reserpin] (ppm) Kurva sandar reserpin metode British Pharmacopoeia (1993) Serapan contoh obat pada λ 389 nm Ulangan Bobot obat (g) Absorbans Kadar dalam Kadar dalam 5 ml larutan 1 obat (mg) x Contoh perhitungan ulangan 1: y x x x μg/ml Kadar reserpin dalam 5 tablet obat bobot 0.5 g obat s Batas galat (95%) SBR 1.51% kadar dalam 0.5 g obat volume larutan bobot 5 tablet ppm 0.05 ml g mg g

23 lanjutan Lampiran 8 Kadar reserpin dalam 1 tablet kadar reserpin dalam 5 tablet 5 Simpangan baku ( x) n i 1 x i n mg mg mg s Simpangan baku relatif (%) 100% x mg 100% 1.51% mg Batas galat t s n mg mg 6

24 3 Lampiran 9 Uji statistika metode SDUV dan metode British Pharmacopoeia (1993) s 1 (s metode SDUV) s (s metode British Pharmacopoeia) (s F hitung 1 ) (s ) (0.004) (0.0036) F tabel (derajat bebas 5 pada selang kepercayaan 95%) F hitung < F tabel (tidak berbeda nyata) S (n )s (n )s (n 1 + n ) S x 10-3 t hitung (x 1 x ) s n 1 n ( ) x t tabel (derajat bebas n 1 + n 9 pada selang kepercayaan 95%).60 t hitung > t tabel (berbeda nyata)