PENGEMBANGAN TEBU PRODUK REKAYASA GENETIK SUT DENGAN INSERSI GEN SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE

Transkripsi

1 Agritro, Agritro, Vol. Desember 15 (2): ISSN EISSN Volume 15 (2) 266 htt://jurnal.unmuhjember.ac.id/ index.h/agritrop PENGEMBANGAN TEBU PRODUK REKAYASA GENETIK SUT DENGAN INSERSI GEN SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE DEVELOPMENT OF GENETICALLY MODIFIED PRODUCTS SUGARCANE WITH INSERTSING GENE FOR SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE Mohamad Syaifudin Aswan Prodi Pendidikan Biologi FP MIPA, IKIP PGRI Jember Abstrak Tebu roduk rekayasa genetika SUT (PRG SUT) meruakan tebu overeksresi gen SoSUT1 yang diketahui mamu meningkatkan roduksi Sucrose trasorter (SUT). SUT meruakan rotein membrane yang berfungsi sebagai rotein transorter sukrosa dari jaringan asimilasi ke jaringan enyimanan. Peningkatan translokasi sukrosa harus di imbangi dengan eningkatan sintesis sukrosa di organ asimilasi. SoSPS1 meruakan gen engkode Sucrose hoshate synthase yang meruakan enzim kunci dalam sintesis sukrosa di sitosol. Insersi gen SoSPS1 ada tebu Produk rekayasa genetika SUT diandang erlu untuk mendaatkan tebu dengan sintesis sukrosa tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mendaatkan tanaman tebu roduk rekayasa genetic SUT - SPS. Insersi gen SoSPS1menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens LBA4404 embawa konstruk KYS-SoSPS1. Parameter keberhasilan enelitian ini adalah terintegrasinya konstruk KYS-SoSPS1 kedalam genon tanaman Tebu PRG SUT dengan uji ketahanan terhada media seleksi antibiotik dan analisis PCR. Penelitian ini berhasil mendaatkan 10 tanaman tebu PRG SUT-SPS. Kata Kunci: Tebu PRG SUT, insersi genetic, Sucrose hoshate Synthase Abstract Sugarcane of genetically modified roducts SUT are SoSUT1 gene overexression sugarcane that is known to increase the roduction of Sucrose trasorter (SUT). SoSUT1 gene is coding Sucrose trasorter (SUT) rotein. SUT is a membrane rotein that serves as sucrose transorter rotein from the assimilation tissues to the storage tissues. To get sugarcane with high sucrose content, Increasing translocation of sucrose should be offset by increasing synthesis of sucrose in the assimilation organs. SoSPS1 gene is a gene sucrose hoshate synthase coding that is a key enzyme in the sucrose synthesis in the cytosol. Transformation of SoSPS1 gene uses Agrobacterium tumefaciens LBA4404 carrier KYS -SoSPS1 on sugar cane of genetically modified roducts event 2 and 20 is deemed necessary to get the sugar cane with high sucrose synthesis. This research aims to get sugarcane with the overexression of SoSPS1 gene in sugar cane PRG SUT event 2 and 20. The success of this research is the integration of the KYS- SoSPS1 construct into genon of target lant by the resistance test to antibiotic selection and PCR analysis. This research succeeded to get 10 SUT- SPS transgenic sugarcane.

2 267 Keywords: Genetic Transformation, Sugarcane Event 2 and 20, Sucrose hoshate Synthase Pendahuluan Tebu (Saccarum officinarum L.) meruakan tumbuhan enghasil gula (Sukrosa). Akumulasi sukrosa ada tanaman diengaruhi oleh tingkat asimilasi karbon dan sintesanya (Caves at al., 2000) serta diengaruhi oleh laju transortasi sukrosa dari organ asimilasi (source) ke organ enyimanan (sink) (Khun & Cristoher., 2010). Enzim yang bereran dalam sintesis sukrosa, diantaranya adalah Sucrose hoshate synthase (SPS) dan sucrose hoshate hoshatase (SPP) Caves.,at al (2000). SPS bereran mengkatalisis UDPglucose dan Fructose-6-hoshat menjadi Sucrose-6-hosate yang meruakan substrat SPP untuk membentuk sukrosa (Cheikh & Brenner, 1992). Aktivitas SPS berkorelasi nyata dengan ertumbuhan dan roduksi gula (Sugiharto.,1997). SPS ada tanaman bereran dalam meningkatkan laju sintesis sukrosa (Hubber & hubber 1992). Gen engkode untuk SPS secara alami telah dimiliki oleh beberaa tanaman, ada tebu disebut dengan gen Saccarum officinarum Sucrose Phoshate Synthase (SoSPS1). Persiaan Ekslan Metode Planlet in-vitro tebu PRG SUT event 2 dan 20 dierbanyak ada media Transortasi sukrosa dari organ asimilasi (source) ke organ enyimanan (sink) difasilitasi oleh rotein Sucrose Transorters (SUT) (Miswar et al., 2007). Gen engkode rotein SUT ada tebu disebut dengan gen Saccarum officinarum Sucrose Transorter (SoSUT). Tebu Produk rekayasa genetik (PRG) SUT meruakan tebu overeksresi gen SoSUT1 hasil Insersi gen SoSUT1 ada enelitian sebelumnya. Tebu tersebut memiliki tingkat transort sukrosa yang tinggi. Peningkatan transort sukrosa erlu diimbangi dengan eningkatan sintesis sukrosa. Insersi gen sucrose hoshate syntase tebu PRG SUT menjadi alternatif untuk mendaatkan tebu dengan tingkat sintesis dan translokasi sukrosa tinggi. Insersi gen SoSPS1 ada tebu PRG SUT menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dengan konstruk lasmid KYS- SoSPS1. Penelitian ini bertujuan untuk mendaatkan tebu PRG SUT SPS. Penelitian ini berhasil mendaatkan 10 tebu PRG SUT-SPS. Murashige Skoog (MS) + 2mgl -1 2,4D + 2mgl -1 BAP + Hygromycin 20 mgl -1. Planlet disubkultur setia 3 minggu sekali hingga mendaatkan 100 lanlet in-vitro ada masing-masing event.

3 268 Pengkulturan Agrobacterium Koloni tunggal dari Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 ditumbuhkan ada 2 ml YEP (Yest Ekstrak Peton) yang mengandung antibiotik rifamycin 50 mgl -1, kanamisin 50 mgl -1, dan Stretomicyin 30 mgl -1, kemudian diinkubasi ada orbital seker dengan suhu 28 o C keceatan 150 rm selama 24 jam. Konfirmasi KYS-SOSPS1 ada Agrobacterium Keberadaan gen target ada Agrobacterium harus ketahui sebelum insersi gen dilakukan. Konfirmasi genetic diawali dengan isolasi DNA, teknik isolasi DNA lasmid dari sel bakteri dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989). DNA hasil isolasi digunakan sebagai cetakan DNA dalam analisis PCR (Polymerase Chain Reaction). Analisis PCR bertujuan untuk konfirmasi keberadaan konstruk KYS-SoSPS1 dengan menggunakan asangan rimer (forward dan reverse) ntii. Primer ntii digunakan untuk konfirmasi gen enyeleksi ntii. T- DNA dari konstruk lasmid KYS- SoSPS1 yang mengandung gen SoSPS1daat di lihat ada gambar 1. Hasil PCR dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa dan divisualisasi dengan Gel Imaging System. Gambar 1. Bagian T-DNA dari konstruk lasmid KYS-SoSPS1 yang mengandung gen SoSPS1 dan gen ketahanan antibiotik Kanamycin (ntii) Infeksi dan Kokultivasi Starter Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang mengandung konstruk KYS-SoSPS1 sebanyak 2 ml disubkultur dalam 50 ml YEP cair yang mengandung antibiotik enyeleksi Kanamycin 50 mgl -1, Rifamicin 100 mgl -1, dan Stetomycin 30 mgl -1, diinkubasi shaker 150 rm ada suhu 28 o C hingga keraatan sel (OD 600 ) mencaai 0,7. Planlet yang berjumlah 100 batang diotong dan diambil bagian angkal seanjang 0,5 cm. Setelah itu, bagian ventral ekslan di lukai dengan 3 samai 6 tusukan jarum steril. Infeksi dilakukan dengan cara merendam ekslan ada 50 ml media YEP cair yang berisi kultur A. tumefaciens dengan enambahan 100 mgl -1 acetosyringone, inkubasi shaker dilakukan ada keceatan 120 rm, suhu 28 o C, dengan kondisi gela, selama 15 menit. Ekslan hasil inkubasi dikering anginkan lalu ditanam ada media kokultivasi selama 3 hari dengan kondisi gela.

4 269 Eliminasi Agrobacterium Planlet dari media kokultivasi dicuci dengan cefotaxime 500 mgl -1 dan dibilas 100 ml aquades steril. Ekslan ditanam ada media eliminasi yang terbuat dari MS + cefotaxime 500 mgl -1 dan diinkubasi ada kondisi terang selama 7 hari. Tahaan seleksi meruakan taha setelah eliminasi. Taha ini membutuhkan waktu 5 siklus inkubasi dengan masing-masing siklus 21 hari dengan kondisi terang. Tanaman tebu yang daat tumbuh hingga seleksi ke 5 disebut sebagai tanaman utative transforman dan dilanjutkan dengan analisis PCR (Polymerase Chain Reaction). Isolasi DNA Genom dan Analisa PCR (Polymerase Chain Reaction) Isolasi DNA genom dilakukan ada 0,2 gr daun. Isolasi menggunakan Genomic DNA Purification Kit Promega. DNA hasil emurnian diukur konsentrasinya menggunakan nano value lus dan kemudian dianalisis PCR (Polymerase Chain Reaction). Analisis PCR dilakukan dengan menggunakan seasang rimer ntii (Neomycin hoshotransferase) yaitu ntii-f (5 -GTC ATC TCA CCT TGC TCC TGCC-3 ) dan ntii-r (5 -GTC GCT TGG TCG GTC ATT TCG-3 ) yang akan mengamlifikasi DNA seanjang 550 b dan rimer htii (Hygromycin hoshotransferase) -F (5 -CCG CAA GGA ATC GGT CAA TA-3 ), rimer htii-r (5 -CCC AAG CTG CAT CAT CGA AA-3 ) yang akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 470 b. DNA hasil amlifikasi diisahkan dengan agarose gel 1% elektroforesis yang mengandung 1,5µl EtBr (Ethidium Bromide) dengan tegangan 100 Volt selama 25 menit. Marker DNA yang digunakan adalah marker 1 kb Ladder sebanyak 3µl. Hasil elektroforesis dilihat dan di dokumentasikan menggunakan alat Gel Imaging System. Aklimatisasi Tebu Transforman Aklimatitasi dilakukan dengan dua taha, ertama angkal lanlet tebu di cuci dengan air mengalir lalu ditanam ada tabung aklimatisasi dengan media asir streril dan di inkubasi ada growth chamber selama ±2 minggu. Aklimatisasi taha kedua tanaman tebu transforman di indah ke green house dengan media tanah dan uuk dalam oly bag. Pemeliharaan tanaman selama aklimatisasi taha ertama dilakukan dengan emberian larutan nutrisi Hoagland (H 6,5). Hasil dan Pembahasan Perbanyakan lanlet dan Ekslan untuk Insersi Proses erbanyakan lanlet membutuhkan waktu ± 5 bulan dengan subkultur setia 3 minggu sekali. Perbanyakan lanlet dilakukan untuk

5 270 memenuhi ± 100 ekslan ada masingmasing event dalam roses Insersi. Ekslan yang digunakan dalam roses Insersi genetik adalah angkal lanlet tebu invitro. Penggunaan ekslan dari angkal lanlet dalam Insersi genetik ada tebu PRG lebih efektif dibandingkan dengan enggunaan kalus. Hal ini sesuai dengan teori Hazmi et al., (2009) yang menyatakan bahwa angkal lanlet meruakan jaringan meristematik yang aktif membelah sehingga memerlukan waktu yang relatif singkat untuk beregenerasi. Penggunaan angkal tunas tebu in-vitro sebagai ekslan untuk Insersi genetik menggunakan A. tumefaciens memiliki beberaa keuntungan misalnya sumber ekslan selalu tersedia dalam jumlah banyak, meminimalisir tingkat variasi somaklonal dan memungkinkan melakukan infeksi secara intensif. Planlet yang diilih sebagai bahan ekslan memiliki kriteria tinggi ± 5 cm, kokoh, dan minimal memiliki 3 helai daun. Ekslan diambil dari angkal lanlet dengan anjang 0,5cm yang diukur dari angkal batang. (gambar 2) Gambar 2. Planlet hasil erbanyakan. A) Gambar yang ditunjukkan oleh anak anah meruakan lanlet yang memenuhi kriteria untuk dijadikan bahan ekslan dan B) bagian lanlet yang diambil untuk ekslan Konfirmasi Keberadaan Konstruk KYS-SoSPS1 dalam Agrobacterium tumefaciens Konfirmasi keberadaan konstruk KYS-SoSPS1 dalam Agrobacterium tumefaciens dilakukan melalui analisis PCR Konfirmasi dilakukan untuk memastikan keberadaan gen SoSPS1 dan htii dalam lasmid bakteri. Hasil PCR dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel agarose 1% menunjukkan bahwa, dengan menggunakan rimer SPS terdaat ita DNA dengan ukuran 600b, sedangkan dengan rimer ntii terdaat ita DNA dengan ukuran 550 b. Pita DNA dengan ukuran 600 b tersebut sesuai dengan anjang DNA SoSPS1 yang teramlifikasi dengan rimer SPS, sedangkan ita DNA dengan ukuran 550 b sesuai dengan ukuran DNA hasil amlifikasi dengan rimer ntii. Hasil analisis PCR ini menunjukkan bahwa bakteri A.

6 271 tumefaciens LBA4404 yang digunakan sebagai vektor dalam Insersi mengandung konstruk KYS-SoSPS1. Gen SoSPS1 sebagai Gen of Interest (Goi) dan gen ntii yang bereran sebagai gen enyeleksi. (Gambar.3) 600b 1000b 750b 500b 550b 250b A Gambar 3. Hasil PCR DNA Plasmid menggunakan Primer SPS dan htii M B Insersi Tebu PRG event 2 dan 20 dengan gen SoSPS1 Insersi genetik ada enelitian ini dilakukan dengan cara menginsersikan gen SoSPS1 ada ekslan tebu Produk Rekayasa Genetik Event 2 dan 20. Insersi dilakukan dengan tahaan sebagai berikut: infeksi, kokultifasi, eliminasi dan seleksi. Taha infeksi memanfaatkan eran Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dengan konstruk KYS-SoSPS1. Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk menginfeksi lanlet dengan keadatan 0,7 ada OD 600. Keraatan tersebut adalah yang otimal. Hal ini sesuai dengan enelitian Setyati (2007) yang menyatakan bahwa keadatan oulasi Agrobacterium tumefaciens yang digunakan ada roses Insersi tanaman tebu adalah kisaran 0,5-1. Pada kisaran OD tersebut diketahui bahwa bakteri berada ada fase logaritmik sehingga roses infeksi lebih otimal. Menurut Mannan et al, (2009) menyatakan bahwa keraatan bakteri yang terlalu rendah daat mengurangi frekwensi insersi T-DNA, sedangkan jika terlalu tinggi daat mengganggu regenerasi tanaman. Kokultifasi bertujuan untuk memberikan kesematan keada Agrobacterium untuk daat tumbuh bersama dengan ekslan, sehingga roses transfer T-DNA daat terjadi. Hasil enelitian ada akhir taha kokultivasi diketahui bahwa dengan keraatan bakteri ada OD 0,7 tidak terjadi over growt atau ertumbuhan bakteri yang berlebih sehingga ekslan masih daat beregenerasi dengan menghasilkan tunas. Eliminasi meruakan taha setelah kokultivasi. Eliminasi bertujuan untuk membebaskan ekslan dari Agrobakterium. Dari hasil engamatan ada taha eliminasi diketahui bahwa dengan enambahan cefotaxim 500 mgl -1 ada media MS0 semua ekslan telah terbebas dari Agrobacterium. Menurut Mathias and Boyd (1986) cefotaxime meruakan antibiotik golongan sefalosorin yang aktif menghambat sintesis etidoglikan terutama bakteri gram negatif. Selain

7 272 itu, menurut Manickavasagam et al. (2004) konsentrasi cefotaxime otimal untuk mengeliminasi sel A. tumefaciens dan tidak bersifat toksik untuk ekslan adalah sebesar 500 mgl -1. Seleksi meruakan taha setelah eliminasi. Seleksi bertujuan untuk mengeliminasi lanlet non transforman. Taha seleksi meruakan faktor kunci yang menentukan keberhasilan metode Insersi genetik. Tebu PRG event 2 dan 20 meruakan tanaman ositif transforman overeksresi gen SoSoSUT1 melalui Insersi menggunakan konstruk lasmid Act- SoSUT1 ada enelitian sebelumnya. Pada tanaman tersebut terdaat gen htii, yaitu gen enyandi rotein yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhada antibiotik higromycin. Antibiotik higromycin daat mengganggu sintesis rotein ada tanaman sehingga akan menghambat ertumbuhan tanaman. Menurut Arago and Brasileiro, (2002) Gen htii menyandi enzim hygromycin-4- fosfotransferase yang daat memfosforilasi gugus hidroksil dari antibiotik hirgromycin kemudian menjadi inaktif sehingga tidak toksik ada tanaman. Planlet tebu PRG event 2 dan 20 kemudian dilakukan Insersi menggunakan gen SoSPS1 sehingga mengandung gen enyeleksi ntii, yaitu gen enyandi rotein yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhada antibiotik kanamycin. Menurut Matthews et al. (1995), mekanisme gen ntii dalam ketahanan terhada antibiotik kanamycin adalah dengan mensintesis enzim neomycin hoshotransferase II yang daat memfosforilasi kanamycin sehingga menjadi inaktif. Taha seleksi ada enelitian ini menggunakan Antibiotik kanamycin 50 mg -1 dan Higromisin 20 mg -1. Hasil uji ketahanan ekslan terhada cekaman antibiotik samai dengan 5 kali seleksi di ketahui bahwa, tebu PRG event 20 dari 100 ekslan yang di infeksi berhasil mendaatkan 10 lanlet atau memeiliki efektifitas Insersi 10%, sedangkan ada event 2 dari 100 ekslan yang di infeksi mendaatkan 12 lanlet atau efektifitas trasnformasi 12%. Planlet yang daat tumbuh dan beregenerasi ada media seleksi diduga telah terinsersi gen ntii dan htii, sehingga lanlet tersebut mamu menginaktifasi aminoglycosida yang dihasilkan olek kanamycin dan higromisin. Hal ini sesuai dengan teori Matthews et al. (1995) yang menyatakan bahwa gen ntii yang telah terinsersi kedalam genom tanaman akan mensintesis enzim neomycin hoshotransferase II yang daat memfosforilasi kanamycin sehingga menjadi inaktif. Sedangkan Menurut Arago and Brasileiro, (2002) Gen htii menyandi enzim hygromycin-4- fosfotransferase yang daat memfosforilasi gugus hidroksil dari antibiotik hirgromycin kemudian menjadi inaktif sehingga tidak toksik ada tanaman.

8 273 Gambar 4. Kondisi tanaman tebu yang daat tumbuh ada cekaman antibiotik ada media seleksi Analisis PCR Tanaman Tebu PRG Hasil Insersi Keberhasilan dari roses Insersi genetik ditandai dengan terintegrasinya gen target kedalam genom tanaman. Konfirmasi keberadaan gen SoSUT1 dan SoSPS1 yang terkandung dalam tanaman utatif transforman dilakukan dengan mendeteksi keberadaan gen enyeleksi ntii dan htii. Hal ini sesuai dengan eta konstruk (Gambar 1) bahwa gen SoSPS1 berada dalam satu kaset T-DNA dengan gen ketahanan antibiotik ntii, sehingga keberadaan gen SoSPS1 bisa dideteksi dengan gen htii. Analisis PCR menggunakan rimer F-R htii didasarkan karena gen SoSUT1 berada dalam satu kaset T- DNA dengan gen ketahanan antibiotik htii (Gambar 5). Gambar 5. Bagian T-DNA dari konstruk lasmid Act-SoSUT1 yang mengandung gen SoSUT1 dan gen ketahanan antibiotik hygromycin Berdasarkan hasil analisis PCR dengan rimer ntii, tanaman tebu PRG event 20 yang mengandung gen ntii terdaat ada 9 tanaman, yaitu A20.1, A20.3, A20.4, A20.5, A20.6, A20.7, A20.8, A20.9.dan A Hasil analisis lanjutan dengan mengkonfirmasi keberadaan gen SoSUT1 dengan rimer ht-f/r menunjukkan bahwa dari 10 samel yang diuji, semuanya ositif mengandung gen htii. Data dari kedua uji PCR tersebut daat di ketahui bahwa

9 274 tebu PRG event 20 yang osistif terinsersi gen SoSUT1 dan SoSPS1 terdaat ada 9 tanaman yaitu: A20.1, A20.3, A20.4, A20.5, A20.6, A20.7, A20.8, A20.9.dan A (gambar 6) Gambar 6. Pita DNA hasil PCR dengan asangan rimer nt-f/r dan ht-f/r ada samel tebu transforman dari tebu PRG event 20 Berdasarkan hasil PCR samel tebu PRG event 2 yang berhasil terinsersi gen ntii terdaat ada event A2.1, A2.2, A2.5, A2.6, A2.7, A2.8, A2.9, A2.11, A2.12 dan A2.13. keberhasilan ini didukung dengan adanya ita tunggal DNA dengan ukuran 550b. Sedangkan yang ositif mengandung gen htii adalah ada event A2.1,A2.3, A2.4, A2.5, A2.6, A2.7, A2.8, A2.10, dan A2.11(Gambar 7). Data dari kedua uji PCR tersebut daat di ketahui bahwa tebu PRG event 2 yang osistif terinsersi gen SoSUT1 dan SoSPS1 terdaat ada 7 tanaman yaitu A2.1, A2.5, A2.6, A2.7, A2.8, A2.11, dan A2.12. Gambar 7. Pita DNA hasil PCR dengan asangan rimer nt-f/r dan ht-f/r ada samel tebu transgenik dari tebu PRG event 2. Aklimatisasi Tebu Transforman Hasil engamatan, aklimatisasi taha I ada event 20 dari 9 tanaman

10 275 yang daat beradatasi ada lingkungan hanya 3 tanaman yaitu A20.1, A20.5 dan A20.9, sedangkan ada aklimatisasi taha II, dari ke 3 tanaman tersebut daat tumbuh dengan baik. Pada event 2 dari 7 tanaman semuanya daat beradatasi dengan baik, kondisi tanaman secara umum daat dilihat ada gambar 8. A B C D Gambar 8. Kondisi lanlet ada saat aklimatisasi. A dan B Planlet yang tidak mamu berdatasi ada 7 dan 14 hari setelah tanam. C dan D lanlet yang mamu berdatasi dengan lingkungan Penyebab Kematian tanaman ada saat aklimatisasi disebabkan oleh infeksi jamur. Zulkarnain (2011) mengatakan bahwa, Lingkungan in - vitro dicirikan dengan kelembaan yang tinggi, bebas dari atogen, sulai hara yang otimal, intensitas cahaya yang rendah dan sulai hara yang cuku ada media. Sedangkan ada kondisi in-vivo memiliki kondisi sangat berbeda, sehingga tanaman mudah mengalami stres dan terinfeksi oleh mikro organisme yang berakibat ada kematian. Hal ini yang diduga sebagai enyebab kematian ada sebagian besar lanlet yang berasal dari event 20. Kesimulan Kesimulan dan Saran Berdasarkan hasil Insersi telah didaatkan tanaman tebu PRG SoSPS1 ada tebu event 2 sebanyak 7 tanaman yaitu event A2.1, A2.4, A2.5, A2.6, A2.7, A2.10, dan A2.11, sedangkan ada event 20 mendaatkan 3 tanaman yaitu ada event A20.1, A20.5 dan A20.9. Saran Perlu dilakukan analisis lebih lanjut secara fisiologis mengenai engaruh overeksresi ganda gen SoSUT1 dan SoSPS1 terhada tingkat sintesis, translokasi, dan akumulasi sukrosa ada batang tanaman tebu transforman. Daftar Pustaka Arago, F. and Brasileo, C Positive, Negative and Marker-free Strategies for Transgenic Plant

11 276 Selection. Braz. J. Plant Physiol. Vol. 14 (1): Chavez, B. A. T., J. J. Valdez- Alarco n., M. Marti nez-trujillo., L. Chen., B. Xoconostle-Ca zares., W. J. Lucas., L. Herrera-Estrella Tissue-secific and develomental attern of exression of the rice SPS1 Gene. Plant Physiology. Vol.124: Cheikh, N., and Brenner, M. L Regulation of Key Enzymes of Sucrose Biosynthesis in Soybean Leaves: Effect of dark and light conditions and role of gibberellins and abscisic acid. Plant Physiol. Vol.100: Hazmi, M Pengembangan metode Insersi melalui Agrobacterium tumefaciens ada ekslan angkal tunas tebu in vitro. Disertasi (tidak diublikasikan). Universitas Brawijaya. Malang. Huber, S.C. and J.L Huber Role of sucrose hoshate synthase in sucrose metabolism in leaves. Plant Physiol. Vol.89: Kuhn, C. and Christoher Sucrose transorters of higher lants. Current Oinion in Plant Biology. Vol.13 :1 11. Mannan,A.,T. Noor Syed.,and B. Mieza Factor affecting Agrobacterium tumefaciens mediated Transformation of Artemisia absinthium L. Pakistan Journal Bot. Vol.41 (6): Manickavasagam, M., A. Ganaathi, V. R. Anbazhagan, B. Sudhakar, N. Selvaraj, A. Vasudevan, dan S. Kasthurirengan Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation and Develoment of Herbicide-Resistant Sugarcane (Saccharum secies hybrids) Using Axillary Buds. Plant Cell Re. Vol. 23: Mathias, R.J. and L.A. Boyd, Cefotaxime Stimulates Callus Growth, Embryogenesis and Regeneration in Hexaloid Bread Wheat (Triticum aestivum L. em Thell). Plant Sci. Vol. 46: Matthews, B. F., J.A. Saunders, J.S. Gebhardt, J. J. Lin dan S.M. Koehler Plant Cell Electrooration and Electrofusion Protocols: Reorter Genes and Transient Assays for Plants. Plant Sciences. Vol. 55: Miswar Peningkatan biosintesis sukrosa tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) melalui overekresi gen Sucrose Phosate Synthase (SPS). Disertasi (tidak diublikasikan). Universitas Jember. Jember. Setyati, S., P. Oktaviandari, M. Hazmi dan B. Sugiharto Studi erbandingan metode Insersi dna menggunakan vector Agrobacterium tumefaciens ada tanaman tebu (Saccharum hybrid). Berk. Penel. Hayati. Vol.13: Zulkarnain,H Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta:PT Bumi Aksara Sugiharto, B., H. Sakakibara., Sumadi., T. Sugiyama Differential exression of two genes for sucrose hosat synthase in sugarcane: moleculer cloning of two cdnas and comarative analysis of gene exression. Plant Cell Physiol. Vol.38 : Zulkarnain, H Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta:PT Bumi Aksara