BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan cairan tubuh manusia yaitu plasma secara in vitro. 3.2 Subyek Penelitian Subyek penelitian merupakan pendonor sehat yang telah mengisi formulir donor darah dari Palang Merah Indonesia Kabupaten Sleman (Lampiran 2) dan telah memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi sebagai berikut: Kriteria inklusi penelitian: 1. Pendonor laki-laki dan/atau perempuan usia tahun 2. Pendonor sehat (telah memenuhi persyaratan sebagai pendonor PMI) Kriteria eksklusi penelitian: 1. Pendonor sedang mengkonsumsi obat-obatan 2. Pendonor memiliki penyakit infeksi menular melewati darah 3.3 Bahan dan Alat Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah standar Vankomisin HCl (grade BPFI, BPOM), Plasma (PMI), Metanol (grade HPLC, J.T.Baker), Akuabides (Ikapharmindo), kalium dihidrogen fosfat (grade pro analisis, Merck), dan Diklorometan (grade pro analisis, Merck), Asam Klorida (grade pro analisis, Merck), Asam Ortofosfat (grade pro analisis, Merck) Alat Alat yang digunakan adalah seperangkat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Waters Alliance e2695) Detektor UV (Waters 2487), timbangan analitik (Metler Toledo XS 205, kepekaan 0,01 mg), Ultrasonic (5510 Branson), vortex (Ika MS 3 Digital), sample tube 1,5 ml (Abdos), 13

2 14 alat sentrifugasi, ph meter (SevenEsay mettler Toledo), syringe filter 0,20 μm (Acrodisc LC PVDF), mikropipet (Thermo Scientific), whitw tip (Axygen), blue tip (Ekstra Gene), yellow tip (Thermo), dan alat-alat gelas. 3.4 Tahapan Penelitian Penelitian ini dibagi dalam beberapa tahapan, serta dijelaskan dalam gambar 3.1. Secara umum penelitian ini diawali dengan pembuatan larutan stok yang kemudian di spiked dengan plasma manusia, plasma manusia diperoleh dari PMI dengan prosedur penyiapan plasma terlampir pada Lampiran 3, plasma manusia yang telah di spiked dilakukan proses deproteinasi dan ekstraksi cair-cair. Validasi yang dilakukan meliputi uji selektivitas, linearitas, presisi, dan akurasi. Preparasi sampel (plasma manusia + vankomisin HCl) Pembuatan kurva kalibrasi vankomisin HCl dalam spiked-plasma Validasi metode analisis Linieritas dan rentang Selektivitas Akurasi dan presisi Gambar 3.1 Skema alur penelitian

3 Pembuatan 5 mm KH 2 PO 4 ph 3,00 Ditimbang kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ) sebanyak gram, dilarutkan dalam labu ukur 500 ml dan ditambahkan aquabidestilata sampai tanda batas. Larutan di sonic menggunakan ultrasonic bath selama 10 menit. Dicek ph dapar menggunakan ph meter dan ditambahkan asam ortofosfat 5% hingga dicapai ph 3,00. Kemudian disaring menggunakan membran filter 0,45 µm Pembuatan larutan stok dan kurva baku vankomisin dalam matriks plasma Larutan stok standar dibuat dengan melarutkan vankomisin hidroklorida setara dengan 10 mg vankomisin ke dalam labu ukur 10 ml menggunakan pelarut dari campuran 5 mm KH 2 PO 4 ph 3,00 : Metanol (80:20 v/v). Kurva kalibrasi dibuat dengan menambahkan larutan hasil pengenceran larutan stok vankomisin ke dalam matriks plasma untuk membuat larutan seri kadar dengan konsentrasi 3,0 µg/ml; 10,0 µg/ml; 20,0 µg/ml; 30,0 µg/ml; 50,0 µg/ml; dan 60,0 µg/ml. Pengenceran larutan stok menggunakan pelarut 5 mm KH 2 PO 4 ph 3,00 : Metanol (80:20 v/v). Larutan seri kadar digojog hingga homogen, kemudian divortex selama 1 menit dan dilakukan sonic selama 10 menit menggunakan ultrasonic bath. Setiap 200 µl plasma yang telah di spike kemudian dideproteinasi menggunakan 400 µl Metanol. Selanjutnya sampel dihomogenkan dengan menggunakan vortex selama 60 detik dan disentrifugasi pada rpm selama 10 menit. Supernatan diambil sebanyak 400 µl ditambahkan HCl ph 3,00 sebanyak 500 µl, diekstraksi menggunakan diklorometan 1,0 ml dan disentrifugasi pada rpm selama 10 menit, diambil fase air disaring dengan membran filter 0,20 µm. Kemudian disuntikan sampel sebanyak 20 µl dengan laju alir 1,0 ml/menit dan fase gerak dengan komposisi 5 mm KH 2 PO 4 ph 3,00 : Metanol (80:20 v/v) ke alat KCKT pada panjang gelombang 213 nm. Dilakukan 5 kali replikasi pada tiap kadar. Prosedur penyiapan larutan stok dan kurva baku terlampir pada Lampiran 4.

4 Pengukuran linieritas, LoD, LoQ dan LLoQ Uji ini diperoleh dari hasil kurva baku vankomisin dalam spiked-plasma. Nilai koefisien korelasi (r) diperoleh dari persamaan y=bx+a. Nilai LoD setara dengan 3,3 x (Sy/x)/b, LoQ setara dengan 10 x (Sy/x)/b dan LLoQ setara dengan 5 x (Sy/x)/b Penentuan selektivitas vankomisin Disiapkan 6 larutan plasma yang berasal dari individu yang berbeda lalu ditambahkan vankomisin dengan kadar LLoQ dari larutan stok. Kemudian larutan divortex selama 1 menit. Setiap 200 µl plasma yang telah di spike kemudian dideproteinasi dan diekstraksi cair-cair. Kemudian sebanyak 20 µl sampel disuntikan ke alat KCKT dengan laju alir 1,0 ml/menit pada panjang gelombang 213 nm. Dilakukan 2 replikasi tiap plasma yang berasal dari individu yang berbeda. Dilakukan perhitungan simpangan baku relatif (CV) dan % diff -nya Penentuan akurasi metode Dibuat larutan vankomisin dalam plasma dengan 4 kadar yaitu pada LLoQ, 5 LLOQ (low QC), setengah dari nilai penjumlahan low QC dan high QC (medium QC), dan 80% dari titik teratas rentang kalibrasi (high QC) dari larutan stok. Setiap 200 µl plasma yang telah di spike kemudian dideproteinasi dan diekstraksi cair-cair. Kemudian disuntikan sampel sebanyak 20 µl dengan laju alir 1,0 ml/menit kealat KCKT pada panjang gelombang maksimal. Dilakukan 5 kali replikasi pada tiap kadar dan dilakukan uji selama 3 hari Intra-assay accuracy (within day variation) dan Intra-assay accuracy (day to day variation). Dilakukan perhitungan % diff -nya.

5 Penentuan presisi metode Dibuat larutan vankomisin dalam plasma dengan 4 kadar yaitu pada LLoQ, 5 LLOQ (low QC), setengah dari nilai penjumlahan low QC dan high QC (medium QC), dan 80% dari titik teratas rentang kalibrasi (high QC) dari larutan stok. Setiap 200 µl plasma yang telah di spike kemudian dideproteinasi dan diekstraksi cair-cair. Kemudian disuntikan sampel sebanyak 20 µl dengan laju alir 1,0 ml/menit kealat KCKT pada panjang gelombang maksimal. Dilakukan 5 kali replikasi pada tiap kadar dan dilakukan uji selama 3 hari Intra-assay accuracy (within day variation) dan Intra-assay accuracy (day to day variation). Dilakukan perhitungan simpangan baku relatif (% CV). 3.5 Analisis Data Hasil validasi metode bioanalisis vankomisin dalam plasma ditunjukkan dalam bentuk kromatogram. Analisis data selektivitas, presisi, dan akurasi dengan menghitung nilai CV dan % diff. Nilai tersebut dibandingkan dengan kriteria nilai CV dan % diff yang ditetapkan oleh FDA (FDA, 2001) dan European Medicines Agency (EMEA) (EMEA, 2011). Persamaan yang digunakan dalam penelitian ini tertera pada daftar persamaan.