STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT EDI HUSEN

Transkripsi

1 STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT EDI HUSEN SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

2

3 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Januari 2012 Edi Husen NRP: G

4

5 ABSTRACT EDI HUSEN. Study on Pseudomonas Producing ACC Deaminase in Increasing Growth and Survival of Soybean Against Disease. Under direction of ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO and GIYANTO. 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase-producing bacteria have been known to help plant growth by preventing the inhibition-effect of increase concentration of ethylene in higher plants, which is commonly triggered by high concentration of indole-3-acetic acid (IAA) and/or by the presence of plant pathogens in the vicinity of the root. The enzyme degrades ACC (precursor of ethylene) into ammonia and α-ketobutirate as bacterial sole source of nitrogen. This study examined the potential use of Pseudomonas isolates producing ACC deaminase in increasing soybean growth and survival against pathogenic fungi Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Eighty one isolates of IAA-producing Pseudomonas (1.13 to µg IAA ml -1 ) were screened in planta for their ability to promote soybean growth in growth chamber conditions. The selected isolates were assessed in vitro for their ACC deaminase activity and compatibility with root-nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum BJ11 and Sinorhizobium fredii Rif5, and tested to promote soybean growth and reduce disease incidence caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani under greenhouse conditions. The results showed that 13 out of 81 isolates significantly increased soybean root length and weight, up to 50% from untreated plants. Of 13 isolates, 11 isolates were able to use ACC as their sole source of nitrogen as an indication of their ACC deaminase activities. Two isolates that did not show ACC deaminase activities had lower capacity to produce IAA (5.45 to 6,31 µg IAA ml - 1 ). Three out of 11 isolates inhibited at least one strain of root-nodule bacteria, thereby limiting their use for soybean. Eight selected isolates increased soybean height and fresh weight although not all were significantly different from untreated control. On the other hand, most isolates significantly increased the survival rates of soybean in soil containing pathogenic fungi. Disease suppression of the isolates caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani was 17.1, 36.4 and 64.5%, respectively. The higher the destructive effect of the pathogens as shown by S. rolfsii and R. solani treatments, the better was the ability of the isolates to reduce the disease. Further work is worth to evaluate whether or not the fertility status of the soil or a particular pathogen influence the beneficial effects of these bacteria on soybean. Key words: ACC deaminase, Fusarium oxysporum, growth promotion, IAA, Pseudomonas, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, soybean disease.

6

7 RINGKASAN EDI HUSEN. Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO dan GIYANTO. Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase) (E.C ) merupakan enzim yang diproduksi oleh beberapa rizobakteri untuk mendegradasi substrat ACC (prekursor hormon etilen) sebagai sumber nitrogen. Degradasi ACC secara aktif oleh rizobakteri akan mengurangi biosintesis hormon etilen. Dalam banyak kasus, biosintesis etilen yang berlebihan dalam jaringan akar akan menghambat perkembangan akar dan melemahkan ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit. Beberapa faktor pemicu biosintesis etilen pada tanaman banyak terkait dengan cekaman (stres) akibat kondisi lingkungan yang tidak mendukung, serangan hama penyakit, dan peningkatan konsentrasi hormon asam indol asetat (indole acetic acid, IAA). Dari berbagai hasil penelitian, inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan mengoptimalkan peran IAA dalam memacu pertumbuhan tanaman dan meningkatkan daya tahan tanaman terhadap serangan patogen. Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil ACC deaminase sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya pada tanaman kedelai merupakan salah satu alternatif teknologi yang menjanjikan untuk meningkatkan kualitas pertumbuhan tanaman dan mengatasi banyaknya serangan penyakit pada pertanaman kedelai. Penggunaan bakteri ini dapat mengurangi pemakaian senyawa agrokimia sintetik yang berlebihan (pupuk dan pestisida) yang berpotensi mencemari lingkungan. Tantangannya adalah terletak pada kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul yang dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar kedelai (rhizobia). Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas lokal penghasil enzim ACC deaminase dan mempelajari kemampuannya meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit melalui serangkaian penelitian di laboratorium dan rumah kaca. Untuk mencapai tujuan ini dilakukan penapisan (screening) isolat secara in planta dan in vitro di laboratorium. Isolat-isolat terbaik selanjutnya diuji keefektivannya pada tanaman kedelai menggunakan tanah steril dan non-steril. Mikroba yang digunakan mencakup isolat Pseudomonas asal rizosfer tanaman kedelai, yaitu 81 isolat penghasil IAA (1,13 20,49 µg IAA ml -1 ) dan 1 isolat bukan-penghasil IAA; cendawan patogen Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, dan Fusarium oxysporium; bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum BJ11 dan Sinorhizobium fredii Rif5. Varietas kedelai yang digunakan adalah varietas Wilis. Tanah untuk percobaan pot menggunakan tanah pertanian yang diperoleh dari areal pertanian di sekitar Leuwiliang-Jasinga, Bogor. Hasil penapisan in planta menggunakan media steril kantong-tumbuh (growth pouch) di ruang penumbuh (growth chamber) diperoleh 13 dari 81 isolat Pseudomonas penghasil IAA yang mampu meningkatkan panjang dan bobot akar bibit kedelai sampai 50% dibanding perlakuan kontrol. Dari 13 isolat ini, 11 diantaranya memiliki aktivitas ACC deaminase berdasarkan kemampuannya

8 mendegradasi substrat ACC pada media garam minimal. Hasil yang diperoleh memperlihatkan peran fisologis bakteri penghasil ACC deaminase dalam memacu pertumbuhan tanaman kedelai tanpa terpengaruh oleh peran isolat ini yang juga mampu mensintesis hormon IAA. Dua isolat yang tidak memiliki aktivitas ACC deaminase, yaitu Pseudomonas Crb31 dan Crb86, tergolong isolat yang rendah kemampuannya menghasilkan IAA (5,45 dan 6,31 µg IAA ml -1 ) dibanding isolat lain. Hasil uji kompatibilitas isolat dengan bakteri bintil akar menunjukkan bahwa 3 dari 11 isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase bersifat antagonis terhadap bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan/atau S. fredii Rif5. Sifat antagonis ini diindikasikan oleh zona penghambatan pertumbuhan di sekeliling koloni Pseudomonas yang ditumbuhkan bersama dengan bakteri bintil akar pada media agar. Ketiga isolat ini tidak potensial digunakan untuk tanaman kedelai. Delapan isolat penghasil ACC deaminase yang tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar, yaitu Pseudomonas Crb5, Crb12, Crb17, Crb24, Crb46, Crb47, Crb49, dan Crb56. Inokulasi kedelai dengan masing-masing dari delapan isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase sebagian mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai (umur 14 hari) pada tanah steril dan non-steril di rumah kaca. Data tinggi dan bobot tanaman yang diinokulasi dengan isolat ini lebih tinggi dibanding tanaman yang tidak diinokulasi (kontrol). Hasil terbaik peningkatan pertumbuhan kedelai pada tanah steril ditunjukkan oleh isolat Pseudomonas Crb5, Crb24, Crb46, dan Crb 56, sedangkan pada tanah non-steril oleh isolat Crb12, Crb17, dan Crb24. Berbedanya respon tanaman kedelai pada tanah steril dan non-steril diduga terkait dengan interaksi isolat terhadap mikroba alami, baik yang bersifat positif maupun negatif terhadap isolat yang diintroduksi. Isolat Crb5, Crb46, dan Crb56 mampu meningkatkan bobot akar pada tanah steril, namun tidak berpengaruh pada tanah non-steril. Sedangkan isolat Crb12, Crb17, dan Crb47 justru efektif meningkatkan pertumbuhan kedelai pada tanah non-steril atau dengan kehadiran mikroba alami. Rendahnya tingkat kesuburan tanah yang digunakan dalam penelitian ini diduga juga berpengaruh terhadap keefektivan isolat dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai. Inokulasi kedelai dengan isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cendawan patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani. Tingkat penekanan penyakit oleh isolat yang disebabkan oleh patogen F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R. solani berturut-turut mencapai 17,1%; 36,4%; dan 64,5%. Kemampuan isolat meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit cenderung meningkat dengan meningkatnya tingkat cekaman patogen. Jumlah tanaman yang mati yang disebabkan oleh F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R. solani berturut-turut mencapai 15%, 31%, dan 42%. Diduga induksi pembentukan ACC deaminase pada isolat meningkat dengan semakin meningkatnya tingkat cekaman patogen. Studi mendalam tentang sifat spesifik maupun generik peran Pseudomonas penghasil ACC deaminase dalam meningkatkan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit sangat berharga untuk dilakukan.

9 Hak cipta milik IPB, tahun 2012 Hak cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

10

11 STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT EDI HUSEN Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Mayor Mikrobiologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

12 Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Suryo Wiyono, MSc.Agr Dr. Ir. Dyah Manohara, MS Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Dr. Iswandi Anas, M.Sc Dr. Pingkan Aditiawati

13 Judul Disertasi Nama NRP : Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit : Edi Husen : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si Ketua Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc Anggota Dr. Ir. Giyanto, M.Si Anggota Diketahui: Koordinator Mayor Mikrobiologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr. Ir. Gayuh Rahayu Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr Tanggal ujian: 26 Oktober 2011 Tanggal lulus:

14

15 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan kasih sayang-nya, sehingga disertasi yang berjudul Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit telah berhasil diselesaikan. Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, Prof. Dr. Antonius Suwanto, dan Dr. Giyanto yang telah memberikan bimbingan dan arahan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan disertasi. Penelitian ini terlaksana berkat dukungan dana dari proyek Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) antara Badan Litbang Pertanian dan Institut Pertanian Bogor tahun dan dari Program Insentif Peningkatan Kapasitas Iptek Sistem Produksi RISTEK tahun atas nama Dr. Aris Tri Wahyudi. Oleh karena itu, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Terima kasih kepada Pimpinan dan seluruh staf Departemen Biologi, FMIPA IPB dan Laboratorium Mikrobiologi atas segala bantuan fasilitas dan penggunaan alat. Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Sri Rochayati, kepala Balai Penelitian Tanah (Balittanah), Dr. Achmad Rachman (d/h kepala Balittanah), Dr. Muhrizal Sarwani, kepala Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian (BBSDLP), dan Prof. Dr. Irsal Las (d/h kepala BBSDLP) atas izin sekolah dan dukungan yang diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Pimpinan dan seluruh staf Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah dan teman-teman peneliti lingkup Balittanah yang senantiasa memberikan dukungan moril dalam penyelesaian studi. Terima kasih kepada Dr. Dyah Manohara (Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Balittro, Bogor) dan Dr. Suryo Wiyono (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB) atas kesediannya sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup dan saran perbaikan yang diberikan. Terima kasih kepada Prof. Dr. Iswandi Anas (Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, IPB) dan Dr. Pingkan Aditiawati (Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, ITB, Bandung) atas kesediaannya sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka dan saran perbaikan yang diberikan. Ucapan terima kasih kepada istri, Dra. Asih Hendarsih, dan ananda Mahirawan Setiadhi atas kesabaran dan dukungannya yang senantiasa diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2012 Edi Husen

16

17 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 10 September 1960, sebagai anak keempat dari Bapak Nazaruddin Chatib Basa dan Ibu Masitah. Penulis mengenal pertanian sejak menempuh pendidikan pertanian di Sekolah Pertanian Menengah Atas (SPMA) Negeri Bogor tahun dan mengenal ilmu tanah setelah menempuh Pendidikan Kedinasan di Pusat Pelatihan Manajemen dan Kepemimpinan Pertanian (PPMKP) (d/h IPLPP) Ciawi, Bogor pada tahun Pendidikan Sarjana Biologi diselesaikan di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor pada tahun Pendidikan Master of Science dalam bidang Mikrobiologi Tanah diselesaikan di University of the Philippines, Los Banos (UPLB), Philippines pada tahun 2002 dan memperoleh penghargaan Gamma Sigma Delta dari UPLB. Selanjutnya, penulis melanjutkan sekolah S3 Jalur Penelitian (by Research) di Program Studi Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor pada tahun Penulis adalah staf Peneliti Mikrobiologi Tanah di Balai Penelitian Tanah, Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian, Bogor. Selama menjadi mahasiswa S3, penulis telah mempresentasikan sebagian hasil penelitian disertasi pada Seminar Nasional dan Internasional, Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia, pada tahun 2008 di Purwokerto dan pada tahun 2010 di Bogor, dengan judul Growth Enhancement and Disease Reduction of Soybean by ACC Deaminase- Producing Pseudomonads. Selain melaksanakan penelitian disertasi, penulis juga aktif dalam kerja sama penelitian dengan lembaga riset nasional dan internasional, antara lain proyek REDD-ALERT (Reducing Emissions from Deforestation and Degradation through Alternative Landuses in Rainforests of the Tropics), khususnya aspek aktivitas mikroba pada gambut. Pada bulan Juli Agustus 2011 penulis mendapat kesempatan mengikuti pelatihan soil microbiological extraction and quantification techniques, khususnya microbial community fingerprinting using PLFA analysis di Faculty of Bioscience Engineering, University of Gent, Belgia. Penulis juga aktif mempublikasikan berbagai hasil penelitian di media cetak ilmiah maupun populer. Selama masa studi S3, penulis telah mempublikasikan hasil penelitian disertasi ini pada: 1) Microbiology Indonesia, Vol. 2 (3): , 2008, Prospective use of 1- aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing bacteria for plant growth promotion and defense against biotic and abiotic stresses in peat-soil agriculture. 2) Indonesian Journal of Agricultural Science, Vol. 10 (1) 2009: 19-25, Soybean seedling root growth promotion by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing pseudomonads. 3) American Journal of Agricultural and Biological Sciences, Vol. 6 (2) 2011: , Soybean response to 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing Pseudomonas under field soil conditions. 4) American Journal of Applied Sciences, 8: , 2011, Growth enhancement and disease reduction of soybean by 1-aminocyclopropane-1- carboxylate deaminase-producing Pseudomonas.

18

19 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI xix DAFTAR TABEL xxi DAFTAR GAMBAR xxiii DAFTAR LAMPIRAN xxv PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 3 Hipotesis... 3 Manfaat Penelitian... 4 Temuan Baru (Novelty)... 4 TINJAUAN PUSTAKA... 5 Rizobakateri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR)... 5 Enzim ACC Diaminase dan Etilen... 5 Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh Tanaman... 6 Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali Patogen... 9 Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai... 9 BAHAN DAN METODE Tempat Penelitian Bahan Penelitian Tahapan Penelitian Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh Pengujian Aktivitas Enzim ACC Deaminase Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia Uji Pemacu Tumbuh di Rumah Kaca Uji Penekanan Penyakit HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Penapisan Psedomonas Pemacu Tumbuh Tanaman Kedelai Aktivitas ACC Deaminase Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia Pengaruh Pseudomonas terhadap Peningkatan Pertumbuhan Kedelai Pengaruh Pseudomonas terhadap Penekanan Penyakit SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 53

20 DAFTAR TABEL Halaman 1 Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA yang digunakan dalam penelitian ini Isolat-isolat Pseudomonas pada masing-masing set percobaan Aktivitas ACC-deaminase pada media garam minimal Dworkin- Foster (DF) ditambah amonium sulfat dan ACC sebagai sumber N Reaksi penghambatan (antagonis) isolat Pseudomonas terhadap bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5 pada media cawan agar King s B Pertumbuhan kedelai (umur 14 hari setelah tanam) yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada media tanah non-steril di rumah kaca Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen Fusarium oxysporum (Fo) di rumah kaca Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen Sclerotium rolfsii (Sr) di rumah kaca Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen Rhizoctonia solani (Rs) di rumah kaca... 43

21 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari Ose et al. 2003) Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminae untuk mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998) Diagram alir tahapan penelitian Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada rak (B), dan penempatan kecambah kedelai pada tiap kantong tumbuh (C) Biji kedelai yang sudah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas dan dikecambahkan pada cawan Petri (A), dan penempatan kecambah kedelai umur 2 hari pada media kantong tumbuh (B) Skema penempatan pot secara acak dalam uji pemacu tumbuh pada media tanah steril dan tanah non-steril di rumah kaca (K = kontrol tanpa inokulasi; Crb17 adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas Crb17; angka 1 sampai 5 adalah nomor ulangan) Hambatan perkembangan dan pertumbuhan tanaman kedelai pada media agar semi-padat yang diinfestasi dengan cendawan patogen F. oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani Skema penempatan pot pada pengujian ketahanan tanaman kedelai inokulasi dengan Pseudomonas penghasil ACC deaminase terhadap cendawan patogen pada tanah steril (atas) dan non-steril (bawah) di rumah kaca. (FS46-1 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas Crb46 pada ulangan 1; FN56-3 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas Crb56 pada ulangan 3, dan seterusnya) Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan A. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan B. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan C. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol... 29

22 12 Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan D. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan panjang maupun bobot akar Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan panjang maupun bobot akar dan isolat cenderung menghambat panjan dan bobot akar Pertumbuhan isolat Pseudomonas pada cawan-agar media M26 (A), DF + amonium sulfat (B), dan DF + ACC (C) Uji kompatibilitas Pseudomonas dengan rhizobia pada agar cawan King's B, yaitu reaksi antagonis B. japonicum Bj11 terhadap Pseudomonas Crb26 (A) yang ditunjukkan oleh zona penghambatan warna terang di sekeliling koloni isolat (bulatan kertas saring) dan reaksi tidak antagonis S. fredii Rif5 terhadap Pseudomonas Crb56 (B)... 35

23 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Hasil analisis contoh tanah komposit Ultisols dari daerah Leuwiliang, Jasinga, Bogor untuk penelitian di rumah kaca Data hasil analisis varian dan rata-rata perlakuan pada tiap set percobaan di ruang penumbuh (growth chamber) Daftar publikasi hasil penelitian selama masa studi yang diterbitkan pada journal nasional dan international terakreditasi, periode

24 PENDAHULUAN Latar Belakang Berbagai jenis bakteri yang menguntungkan dari kelompok rizobakteri pemacu tumbuh tanaman banyak diteliti dan dikembangkan, antara lain dari genus Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Serratia, Acetobacter, Azotobacter, dan Azospirillum. Selain mampu menghasilkan senyawa pemacu tumbuh dan mengendalikan penyakit, beberapa rizobakteri seperti Pseudomonas juga dikenal sebagai bakteri kompetitif dan paling efisien memanfaatkan sumber hara di lingkungan rhizosfer (Kloepper & Schroth 1981). Manfaat rizobakteri ini terhadap pertumbuhan tanaman telah banyak dilaporkan. Beberapa galur mampu mensintesis zat pengatur tumbuh (fitohormon), menghasilkan enzim 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase untuk mengurangi sintesis hormon etilen yang berlebihan pada masa pertumbuhan vegetatif tanaman, memfasilitasi penyerapan unsur hara di dalam tanah (Glick 1995; Cattelan et al. 1999; Tenuta 2006), dan menghasilkan senyawa atau metabolit seperti siderophore, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik, dan sianida untuk menekan aktivitas patogen (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Wang et al. 2000). Di antara berbagai peran penting ini, bakteri penghasil enzim ACC deaminase mulai banyak diteliti untuk membantu pertumbuhan tanaman. Rizobakteri penghasil ACC deaminase mampu memacu pertumbuhan dan meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress) yang disebabkan berbagai faktor biotik dan abiotik (lingkungan) yang ekstrim, antara lain tingginya hormon IAA (Mayak et al. 1997), genangan (Grichko & Glick 2001), kekeringan (Mayak et al. 2004), adanya polutan organik dan anorganik (Reed & Glick 2005; Belimov et al. 2001), tingginya kadar garam (Saravanakumar & Samiyappan 2007), dan serangan patogen (Wang et al. 2000; Dey et al. 2004; Shaharoona et al. 2006). Enzim ini berperan mendegradasi ACC (prekursor hormon etilen) menjadi amonia dan α-ketobutirat untuk mengurangi pembentukan hormon etilen dalam jaringan akar yang dipicu oleh berbagai faktor biotik dan abiotik ekstrim tersebut (Abeles et al. 1992; Glick 1995). Sebagai hormon senescence yang berperan penting dalam pembungaan dan pematangan buah, peningkatan konsentrasi

25 2 hormon etilen pada awal masa pertumbuhan tanaman menghambat perkembangan akar (Glick 1995; Mayak et al. 1997) dan pembentukan bintil akar (Ma et al. 2003), dan dalam banyak kasus melemahkan ketahanan tanaman terhadap penyakit (Wang et al. 2000; 2006; Dey et al. 2004). Tanaman yang terinfeksi patogen juga dilaporkan sering mengalami cekaman etilen dengan diproduksinya hormon ini dalam jumlah yang berlebihan, sehingga memperparah serangan penyakit (Lund et al. 1998; Van Loon et al. 2006). Dengan demikian, pemanfaatan rizobakteri penghasil ACC deaminase untuk mengendalikan sintesis etilen, terutama pada masa pertumbuhan vegetatif, merupakan salah satu upaya untuk meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan mereduksi tanaman terhadap penyakit. Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil enzim ACC deaminase sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya bagi budidaya tanaman kedelai di Indonesia merupakan salah satu alternatif teknologi yang menjanjikan untuk mengatasi rendahnya kualitas pertumbuhan tanaman yang dapat disebabkan oleh faktor tanah, air maupun penyakit. Selain itu, penggunaan bakteri penghasil ACC deaminase ini dalam sistem budidaya tanaman kedelai akan dapat mengurangi pemakaian senyawa agrokimia sintetik yang berlebihan (pupuk dan fungisida) yang saat ini harganya semakin mahal dan berpotensi mencemari lingkungan. Bakteri dari genus Pseudomonas penghasil IAA yang dipilih sebagai model dalam penelitian ini dikenal kompetitif dan paling efisien dalam memanfaatkan sumber hara di lingkungan rhizosfer (Kloepper & Schroth 1981). Tiga jenis penyakit tular tanah yang juga digunakan sebagai model dalam penelitian ini adalah penyakit busuk kecambah dan busuk akar yang disebabkan oleh cendawan patogen Rhizoctonia solani dan Fusarium oxysporum, dan penyakit hawar batang yang disebabkan oleh cendawan patogen Sclerotium rolfsii. Ketiga jenis patogen ini termasuk penyakit penting pada tanaman kedelai di Indonesia. Kehilangan panen kedelai yang diakibatkan oleh penyakit ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton dari total 147,5 ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al. 2001). Hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian (2005) juga memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan tular tanah R. solani

26 3 mencapai 15,5% dari total serangan penyakit. Tantangan dalam pemanfaatan bakteri penghasil ACC deaminase ini pada tanaman kedelai terletak pada kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul, kompetitif, dan dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar (rhizobia). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas penghasil enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase yang mampu meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit melalui serangkaian penelitian di laboratorium, ruang penumbuh (growth chamber), dan rumah kaca. Secara rinci, tujuan penelitian ini dicapai melalui 3 tahapan utama, sebagai berikut: 1. Penapisan (screening) isolat-isolat Pseudomonas pemacu pertumbuhan kedelai secara in planta di ruang penumbuh (growth chamber) dan pengukuran aktivitas ACC deaminase secara in vitro di laboratorium. 2. Seleksi isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul dan tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar melalui uji kompatibilitas. 3. Pengujian kemampuan isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase dalam meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit yang disebabkan oleh cendawan patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani melalui percobaan di rumah kaca pada media tanah steril dan non-steril. Hipotesis Diperoleh bakteri Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul, mempunyai karakter tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar (rhizobia), dan mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya tahan tanaman kedelai terhadap serangan penyakit.

27 4 Manfaat Penelitian Pemanfaatan Pseudomonas penghasil ACC deaminase sebagai agen hayati dalam sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia akan mendukung upaya peningkatan produksi yang selama ini lebih banyak bertumpu pada penggunaan bahan kimia sintetik (pupuk dan fungisida). Pemanfaatan bakteri ini secara tepat akan mengurangi penggunaan pupuk dan fungisida kimia sintetik yang harganya terus semakin mahal dan pemakaiannya yang berlebihan berpotensi mencemari lingkungan. Sifat bakteri ini yang tidak antagonis terhadap rhizobia dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar penambat N yang alami (native) maupun yang diaplikasikan secara bersamaan. Fungsi ganda karakter ACC deaminase yang dimiliki bakteri ini selain mampu melindungi tanaman dari berbagai cekaman biotik (serangan penyakit) juga diharapkan dapat melindungi tanaman dari berbagai cekaman abiotik (lingkungan ekstrim). Sebagai agen hayati, Pseudomonas penghasil ACC deaminase dapat diperbanyak dan diperbaharui, sehingga dapat digunakan secara berkelanjutan. Temuan Baru (Novelty) Studi bakteri penghasil enzim ACC deaminase dan pemanfaatannya bagi sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia belum pernah dilaporkan. Ditemukannya isolat lokal (indigenous) Pseudomonas penghasil ACC deaminase dari rizosfer tanaman kedelai yang mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya tahan tanaman kedelai terhadap serangan cendawan patogen akan memotivasi kegiatan eksplorasi, isolasi, dan seleksi berbagai jenis bakteri dengan karakter dan fungsi yang sama untuk dikembangkan sebagai pupuk dan fungisida hayati.

28 TINJAUAN PUSTAKA Rizobakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR) Rizobakteri pemacu tumbuh tanaman yang populer disebut plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) diperkenalkan pertama kali oleh Kloepper dan Schroth (1978). Rizobakteri merupakan kelompok bakteri rhizosfer yang memiliki kemampuan mengkolonisasi rizosfer secara agresif dan memberi keuntungan bagi tanaman (Kloepper & Schroth 1978; Schroth & Hancock 1982). Berbagai jenis bakteri telah diidentifikasi sebagai PGPR. Sebagian besar berasal dari kelompok Gram negatif dengan jumlah galur paling banyak dari genus Pseudomonas dan Serratia (Kloepper 1993). Aktivitas rizobakteri di lingkungan perakaran memberi keuntungan bagi pertumbuhan tanaman dengan kemampuannya menyediakan atau memfasilitasi penyerapan berbagai unsur hara dalam tanah serta mensintesis dan mengubah konsentrasi berbagai zat pengatur tumbuh (fitohormon). Selain itu, bakteri ini juga memiliki kemampuan menekan aktivitas patogen dengan cara menghasilkan berbagai senyawa atau metabolit seperti siderophore, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik, dan sianida (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Tenuta 2006) dan enzim aminocyclopropane carboxylate (ACC) deaminase (Glick 1995). Enzim ACC Deaminase dan Etilen Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (E.C ), disingkat ACC deaminase, merupakan enzim sitoplasma yang diproduksi oleh beberapa mikroba. Honma dan Shimomura (1978) menemukan enzim ini pertama kali pada bakteri Pseudomonas sp galur ACP. Enzim ACC deaminase berperan mendegradasi asam amino siklopropanoid 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid atau ACC menjadi α-ketobutirat dan amonia. Asam amino ACC merupakan prekursor hormon etilen pada tanaman, sehingga ketersediaanya menjadi faktor utama dalam biosintesis hormon etilen. Biosistesis etilen pada tanaman dimulai dari proses S-adenosilasi metionin menjadi S-adenosylmethionine yang selanjutnya diubah menjadi ACC (Ose et al. 2003). ACC yang terbentuk dioksidasi menjadi hormon etilen (Gambar 1).

29 6 Gambar 1. Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari Ose et al. 2003) Etilen tergolong hormon senesen yang berperan dalam pematangan buah dan penuaan (Abeles et al. 1992; Mathews & Van Holde 1996). Etilen dalam konsentrasi yang rendah pada masa perkecambahan mempercepat proses perkecambahan atau memecah masa dormansi biji. Namun apabila konsentrasi etilen terus meningkat, perkembangan akar menjadi terhambat. Berbagai hasil penelitian membuktikan bahwa selain berperan dalam pematangan buah, etilen juga berfungsi sebagai antagonis atau modulator bagi berbagai fitohormon lain untuk mencegah pertumbuhan tanaman yang berlebihan (Lieberman & Kunishi 1972; Imaseki 1986; Arshad & Frankenberger 1993). Degradasi prekursor etilen (ACC) oleh bakteri penghasil ACC deaminase melalui interaksi hubungan bakteri-tanaman terbukti mampu mengurangi biosintesis hormon etilen, sehingga perkembangan akar tidak terganggu. Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh Tanaman Berbagai hasil penelitian bakteri pemacu tumbuh mengindikasikan adanya keterkaitan antar berbagai jenis hormon dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Hormon IAA (asam indol asetat) bekerja sama dengan sitokinin. Perbandingan (rasio) konsentrasi kedua hormon ini sangat penting dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman (Mathews & Van Holde 1996). Hasil

30 7 penelitian lain memperlihatkan keterkaitan antara produksi hormon IAA dengan hormon etilen. Okon dan Kapulnik (1986) dan Abbas dan Okon (1993) melaporkan bahwa IAA yang dihasilkan oleh beberapa bakteri Azospirillum brasilense dan Azotobacter paspali mampu meningkatkan jumlah bulu akar dan akar lateral tanaman, sehingga meningkatkan penyerapan air dan unsur hara dari tanah. Namun peningkatan pertumbuhan ini terjadi pada tanaman yang diberi IAA dalam konsentrasi rendah (0,005 µg ml -1 ) dan tanaman yang diinokulasi dengan bakteri yang kemampuan memproduksi IAA-nya rendah. Sintesis IAA yang berlebihan justru menghambat pertumbuhan tanaman (Beyeler et al. 1997). Konsentrasi IAA yang tinggi di lingkungan akar dapat memicu pembentukan ACC, dan ACC yang terbentuk akan dioksidasi menjadi etilen yang dalam konsentrasi tinggi dapat menghambat perkembangan akar (Glick et al. 1998; Mayak et al. 1997; Shah et al. 1997). Hasil penelitian Glick et al. (1998) membuktikan bahwa Pseudomonas penghasil enzim ACC deaminase mampu mengurangi pengaruh penghambatan pertumbuhan tanaman karena meningkatnya hormon etilen dengan cara menghidrolisis ACC yang terbentuk dalam jaringan akar. Mekanisme proses penurunan konsentrasi etilen di dalam lingkungan akar disajikan pada Gambar 2. Pada Gambar 2 terlihat bahwa hormon IAA yang diproduksi oleh mikroba di lingkungan rizosfer (eksogenus) sebagian masuk ke jaringan akar melalui proses kesetimbangan. Hormon IAA ini selain memacu perkembangan sel dan pembentukan akar muda, juga merangsang pembentukan enzim ACC sintase untuk pembentukan ACC. Dalam proses kesetimbangan, sebagian ACC dikeluarkan akar yang selanjutnya didegradasi oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminase menjadi amonia dan α-ketobutirat. Hidrolisis ACC secara terus menerus akan mengurangi jumlah ACC dan pembentukan hormon etilen di dalam akar, sehingga mengurangi pengaruh penghambatan etilen bagi perkembangan akar. Hasil penelitian Wang et al. (2000) membuktikan adanya kemampuan bakteri penghasil ACC deaminase dalam meningkatkan panjang akar pada tanaman kanola dan memperkuat daya tahan tanaman terhadap serangan penyakit.

31 8 Gambar 2. Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminase untuk mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998; 2007).

32 9 Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali Patogen Selain memacu pertumbuhan tanaman, bakteri penghasil ACC deaminase juga berperan dalam meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress) yang ditimbulkan oleh berbagai faktor biotik (serangan patogen) maupun abiotik (lingkungan). Bakteri ini mampu mengurangi tingkat cekaman tanaman dengan mengendalikan pembentukan hormon etilen yang dipicu oleh berbagai faktor biotik dan abiotik ekstrim. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi etilen pada tanaman, khususnya pada awal masa pertumbuhan vegetatif, menghambat perkembangan akar dan melemahkan ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit (Wang et al. 2000; Glick et al. 2007). Studi yang dilakukan Wang et al. (2000; 2006) membuktikan kemampuan beberapa bakteri penghasil ACC deaminase dalam mengendalikan berbagai penyakit akar tanaman yang disebabkan oleh cendawan patogen, seperti penyakit layu rebah (damping off) pada mentimun dan busuk akar pada tomat dan kentang. Hasil penelitiannya membuktikan kemampuan bakteri penghasil ACC deaminase dalam menekan serangan cendawan patogen Pythium ultimum penyebab layu rebah. Tanaman yang terinfeksi patogen sering mengalami cekaman etilen (etilen diproduksi dalam jumlah banyak), sehingga akan memperparah serangan penyakit (Van Loon et al. 2006). Inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti mampu menekan pembetukan hormon etilen dan memperkuat daya tahan tanaman terhadap serangan patogen. Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai Berbagai penyakit tanaman kedelai yang disebabkan oleh cendawan di dalam tanah yang populer dikenal sebagai patogen tular tanah (soilborne disease) sudah banyak diidentifikasi. Beberapa diantaranya adalah cendawan patogen Fusarium oxysporum penyebab busuk akar (root rot) dan tanaman mati mendadak (sudden death syndrome), Sclerotium rolfsii penyebab layu (damping-off) dan hawar batang atau busuk pangkal batang (stem rot), dan Rhizoctonia solani penyebab busuk akar dan busuk kecambah (Colyer 1989; Hartman et al. 1999). Ketiga jenis cendawan patogen ini masih tergolong sebagai penyakit utama tanaman kedelai di Indonesia. Total kehilangan hasil panen kedelai yang

33 10 diakibatkan oleh cendawan ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton dari total 147,5 ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al. 2001). Hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbiumbian (2005) memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan patogen tular tanah R. solani mencapai 15,5% dari total serangan penyakit. Gejala penyakit yang ditimbulkan oleh Fusarium menurut Roy et al. (1997) adalah daun menguning (yellowing), khlorosis dan nekrosis pada daun muda, diskolorasi pada batang, dan busuk akar. Hasil penelitian Mueller et al. (2003) mengindikasikan bahwa sangat sedikit galur kedelai yang tahan terhadap serangan patogen ini. Sedangkan kerugian yang ditimbulkan oleh serangan S. rolfsii sangat bervariasi dan biasanya terjadi pada areal yang terpencar-pencar di sekitar tanaman yang mati (Colyer 1989).

34 BAHAN DAN METODE Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium, ruang penumbuh (growth chamber), dan rumah kaca. Penelitian di laboratorium dan ruang penumbuh dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor. Sedangkan percobaan di rumah kaca dilakukan di Instalasi Rumah Kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu, Bogor. Bahan Penelitian Penelitian ini menggunakan isolat bakteri Pseudomonas; cendawan patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani; bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5; benih kedelai varietas Wilis; plastik kantong tumbuh (growth pouches); dan tanah untuk pengujian tanaman di rumah kaca. Bakteri Pseudomonas yang diuji adalah sebanyak 82 isolat Pseudomonas non-patogen yang diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai di daerah Plumbon, Cirebon, Jawa Barat. Sebanyak 81 isolat merupakan isolat penghasil hormon asam indol asetat (IAA) dengan kemampuan sintesis secara in vitro berkisar dari 1,13 20,49 µg ml -1 (Wahyudi et al. 2007). Isolat Pseudomonas tersebut adalah isolat dengan kode Crb1 sampai Crb6, Crb8 sampai Crb37, Crb39 sampai Crb56, Crb60, Crb74, Crb75, Crb78 sampai Crb87, Crb89, Crb92 sampai Crb95, Crb102, Crb104, dan Crb109 sampai Crb115. Satu isolat yang bukan penghasil IAA, yaitu Pseudomonas Crb38 yang disertakan dalam penelitian ini, digunakan sebagai kontrol negatif. Daftar isolat dan kemampuannya menghasilkan IAA dalam media cair yang diperkaya dengan triptofan (prekursor IAA) disajikan pada Tabel 1.

35 12 Tabel 1. Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA yang digunakan dalam penelitian ini. No Kode Isolat IAA (ppm) No Kode Isolat IAA (ppm) 1 Crb1 10,21 42 Crb43 5,08 2 Crb2 9,58 43 Crb44 3,73 3 Crb3 2,32 44 Crb45 9,65 4 Crb4 9,46 45 Crb46 15,80 5 Crb5 12,75 46 Crb47 10,36 6 Crb6 8,35 47 Crb48 8,98 7 Crb8 7,40 48 Crb49 16,19 8 Crb9 8,98 49 Crb50 10,01 9 Crb10 7,64 50 Crb51 10,17 10 Crb11 8,35 51 Crb52 17,53 11 Crb12 6,68 52 Crb53 16,86 12 Crb13 7,40 53 Crb54 16,90 13 Crb14 3,45 54 Crb55 8,79 14 Crb15 13,99 55 Crb56 18,47 15 Crb16 4,89 56 Crb60 8,04 16 Crb17 16,02 57 Crb74 7,72 17 Crb18 7,82 58 Crb75 7,13 18 Crb19 3,37 59 Crb78 6,40 19 Crb20 5,16 60 Crb79 19,67 20 Crb21 14,15 61 Crb80 4,45 21 Crb22 3,45 62 Crb81 18,67 22 Crb23 13,17 63 Crb82 6,63 23 Crb24 15,16 64 Crb83 5,04 24 Crb25 2,20 65 Crb84 14,63 25 Crb26 12,53 66 Crb85 19,72 26 Crb27 1,98 67 Crb86 6,31 27 Crb28 12,16 68 Crb87 6,26 28 Crb29 2,64 69 Crb89 5,45 29 Crb30 4,31 70 Crb92 1,44 30 Crb31 5,45 71 Crb93 7,60 31 Crb32 2,60 72 Crb94 1,13 32 Crb33 3,26 73 Crb95 7,24 33 Crb34 2,82 74 Crb102 6,48 34 Crb35 12,53 75 Crb104 20,49 35 Crb36 4,39 76 Crb109 9,18 36 Crb37 2,34 77 Crb110 5,85 37 Crb Crb111 10,93 38 Crb39 3,91 79 Crb112 6,88 39 Crb40 8,66 80 Crb113 9,30 40 Crb41 3,73 81 Crb114 9,62 41 Crb42 4,61 82 Crb115 7,75 Sumber: Data hasil penelitian Wahyudi et al. (2007)

36 13 Biakan murni cendawan patogen akar kedelai R. solani diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor, sedangkan F. oxysporum dan S. rolfsii diperoleh dari Dr. Abjad Asih Nawangsih, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor. Bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 diperoleh dari Dr. Aris Tri Wahyudi, Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB Bogor; sedangkan S. fredii Rif5 diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor. Benih kedelai varietas Wilis diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Tanah untuk penelitian di rumah kaca adalah tanah Ultisol lapisan atas (0-20 cm) yang berasal dari tanah pertanian di daerah Leuwiliang-Jasingga, Bogor. Tahapan Penelitian Penelitian dimulai dengan kegiatan penapisan (screening) isolat-isolat Pseudomonas yang mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai pada media steril kantong tumbuh (growth pouch) yang dilaksanakan di ruang penumbuh (growth chamber). Isolat-isolat yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai, selanjutnya diuji aktivitas ACC deaminase dan kompatibilitasnya dengan bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan S. fredii Rif5 secara in vitro. Isolat-isolat Pseudomonas terbaik yang diperoleh, yaitu isolat yang mampu memacu pertumbuhan tanaman, memiliki aktivitas ACC deaminase, dan tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar, selanjutnya diuji pada tanaman kedelai pada tanah pada pot di rumah kaca. Pengujian ini mencakup kemampuan isolat Pseudomonas yang terpilih dalam meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit pada tanah steril dan non-steril di rumah kaca. Secara skematis alur tahapan penelitian disajikan pada Gambar 3.

37 14 Gambar 3. Diagram alir tahapan penelitian

38 15 Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh Penapisan kemampuan isolat-isolat Pseudomonas memacu pertumbuhan tanaman kedelai dilakukan pada media steril kantong tumbuh yang ditempatkan pada rak-rak di ruang penumbuh (Gambar 4). Gambar 4. Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada rak (B), dan penempatan kedelai pada tiap kantong tumbuh (C). Prosedur penapisan dengan kantong tumbuh mengikuti protokol pengujian Liftshitz et al. (1987). Kantong tumbuh terbuat dari plastik tebal tahan panas berukuran 18 cm (lebar) x 19 cm (panjang). Di dalam tiap kantong diberi 3 potongan kertas saring, masing-masing selebar 5 cm dengan panjang seukuran bagian dalam kantong tumbuh. Bagian atas kertas saring diberi lipatan untuk dudukan biji kedelai yang ditumbuhkan. Kantong tumbuh sebelum digunakan disterilisasi dengan autoklaf selama 3 hari berturut-turut (1 jam per hari). Penapisan isolat dilakukan dalam 6 set percobaan (A sampai dengan F), masing-masing set terdiri atas 14 sampai dengan 17 perlakuan (termasuk perlakuan kontrol tanpa inokulasi isolat dan kontrol inokulasi dengan isolat bukan-penghasil IAA Crb38). Isolat Pseudomonas yang digunakan pada masingmasing set percobaan disajikan pada Tabel 2. Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL), masing-masing perlakuan diulang 5 kali, tiap ulangan terdiri atas 3 tanaman (1 kantong tumbuh terdiri atas 3 tanaman), sehingga nilai tiap ulangan merupakan nilai rata-rata dari 3 tanaman.

39 16 Tabel 2. Isolat-isolat Pseudomonas pada masing-masing set percobaan. No. Set Percobaan A B C D E F 1. K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) 2. K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) 3. Crb1 Crb3 Crb2 Crb5 Crb4 Crb9 4. Crb18 Crb15 Crb6 Crb8 Crb10 Crb11 5. Crb19 Crb16 Crb13 Crb12 Crb14 Crb20 6. Crb25 Crb21 Crb17 Crb24 Crb51 Crb30 7. Crb29 Crb26 Crb23 Crb36 Crb55 Crb37 8. Crb33 Crb27 Crb23 Crb39 Crb82 Crb45 9. Crb42 Crb28 Crb31 Crb53 Crb84 Crb Crb44 Crb32 Crb43 Crb75 Crb92 Crb Crb46 Crb34 Crb79 Crb78 Crb93 Crb Crb49 Crb35 Crb80 Crb83 Crb102 Crb Crb60 Crb40 Crb81 Crb87 Crb104 Crb Crb74 Crb41 Crb85 Crb94 Crb109 Crb Crb47 Crb86 Crb110 Crb Crb48 Crb115 Crb114 Crb Crb56 Keterangan: K (Blanko) = tanpa inokulasi dengan isolat; K (Crb38) = inokulasi kedelai dengan isolat yang tidak menghasilkan IAA. Biji kedelai sebelum digunakan disterilisasi dengan alkohol 70% dan larutan natrium hipokhlorida (NaOCl 0,21 M). Biji dibasahi alkohol 70% selama 1 menit, kemudian direndam dalam larutan sodium hipokhlorida (NaOCl) selama 5 menit. Pembilasan untuk menghilangkan sisa NaOCl menggunakan akuades steril, kemudian HCl 0,01 M, dan terakhir dengan akuades steril sebanyak 5 kali. Biji kedelai yang sudah steril diinokulasi dengan masing-masing suspensi sel. Suspensi sel disiapkan dengan menumbuhkan masing-masing isolat dalam media cair King s B selama 24 jam pada mesin pengocok (shaker) pada kecepatan 125 rpm, kemudian dipindahkan ke media cair kaya M26 untuk produksi sel. Komposisi media cair King s B adalah 20 g proteose pepton; 10 ml gliserol; 1,5 g K 2 HPO 4 ; dan 1,5 g MgSO 4.7H 2 O yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Media cair M26 mengandung 10 g ekstrak beef; 10 g pepton; dan 5 g NaCl yang

40 17 dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Sterilisasi media dilakukan dengan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 0,1 MPa selama 15 menit. Suspensi sel pada media cair M26 (setelah ditumbuhkan selama 24 jam pada mesin pengocok pada kecepatan 125 rpm) disentrifus pada kecepatan 4000 g selama 10 menit untuk mendapatkan pelet sel. Pelet sel dibilas dengan akudes steril dan selanjutnya disuspensikan kembali dalam larutan 100 mm MgSO 4 steril (ph 7). Suspensi sel diatur pada absorbansi 0,5 dengan panjang gelombang 780 nm yang jumlah selnya setara dengan sel ml -1. Inokulasi biji kedelai steril dilakukan dengan merendam biji dalam masing-masing suspensi sel isolat ( sel ml -1 ) sesuai dengan masingmasing perlakuan selama 1 jam. Perlakuan kontrol tanpa inokulasi merupakan biji kedelai steril yang direndam pada larutan 100 mm MgSO 4 tanpa sel. Biji yang sudah diinokulasi kemudian dikecambahkan pada kertas saring lembab steril pada cawan Petri dan ditempatkan pada ruang gelap pada suhu 28 o C selama 2 hari. Tiga kecambah kedelai (panjang radikel 1 cm) ditumbuhkan pada tiap kantong tumbuh steril yang diberi 20 ml akuades steril (Gambar 5). Kantong tumbuh yang berisi kecambah kedelai diletakkan tegak lurus pada rak. Kecambah ditumbuhkan selama 7 hari di ruang tumbuh dengan suhu 24 o C dengan intensitas cahaya harian sebesar 1300 lux selama 12 jam dan masa gelap harian selama 12 jam. Perkembangan perakaran dari tiap tanaman dievaluasi dari panjang akar dan bobot akar basah. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam (analysis of variance) yang dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil (least significant difference) antara hasil tanaman yang diinokulasi dan yang tidak inokulasi dengan isolat Pseudomonas. Analisis dilakukan dengan perangkat lunak SAS (statistical analysis software) system for Windows v6.12.

41 18 Gambar 5. Biji kedelai yang sudah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas dan dikecambahkan pada cawan Petri (A), penempatan kecambah kedelai umur 2 hari pada media kantong tumbuh (B). Pengujian Aktivitas Enzim ACC Deaminase Pengujian aktivitas ACC deaminase dilakukan pada isolat Pseudomonas yang mampu meningkatkan panjang dan bobot akar kedelai secara in planta di ruang penumbuh. Media yang digunakan adalah media garam minimal Dworkin- Foster (DF) (Dworkin & Foster 1958) yang diperkaya dengan substrat 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) atau amonium sulfat sebagai sumber nitrogen mengikuti prosedur Glick et al. (1995). Komposisi media DF adalah 4 g KH 2 PO 4 ; 6 g Na 2 HPO 4 ; 0,2 g MgSO 4.7H 2 O; 1 mg FeSO 4.7H 2 O; 10 µg H 3 BO 3 ; 10 µg MnSO 4 ; 70 µg ZnSO 4 ; 50 µg CuSO 4 ; 10 µg MoO 3 ; 2 g glukosa; 2 g asam glukonat, 2 g asam sitrat; 12 g agar (untuk media padat) yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Jumlah ACC atau amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam media DF, masing-masing adalah 0,3033 g ACC atau 2 g amonium sulfat. Kecuali bahan ACC yang tidak tahan panas (heat-labile), semua bahan media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 o C dan tekanan 0,1 Mpa. Bahan ACC disterilisasi dengan membran filter berukuran 0,2 µm sebelum ditambahkan (dicampurkan) ke dalam bahan yang sudah disterilkan. Biakan isolat Pseudomonas ditumbuhkan pertama kali dalam media King s B selama 24 jam. Pelet sel selanjutnya dipanen dengan cara sentrifusi seperti diuraikan di atas. Pelet sel dibilas dengan 100 mm MgSO 4 steril dan selanjutnya diinokulasikan ke media cair dan padat DF, DF + ACC, dan DF + amonium sulfat, masing-masing sebanyak 1 ml (1 x 10 9 sel/ml). Pertumbuhan

42 19 isolat pada media cair dimonitor tiap 6 jam selama 48 jam dengan mengukur kerapatan optik biakan pada panjang gelombang 600 nm mengadaptasi metode yang dijelaskan oleh Wang et al. (2000). Nilai kerapatan optik 0,05 atau lebih, khususnya isolat yang ditumbuhan pada media DF + ACC, mengindikasikan bahwa isolat memiliki aktivitas enzim ACC deaminase. Begitu pula dengan media padat yang inokulasi dengan isolat dengan teknik gores. Isolat yang mampu tumbuh pada salah satu media DF + ACC atau DF + amonium sulfat menjadi indikasi adanya aktivitas enzim ACC deaminase. Penggunaan media DF saja (tanpa ACC maupun amonium sulfat) digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui apakah isolat yang digunakan tergolong bakteri diazotrof yang mampu mendapatkan sumber N dengan menambat N 2 dari udara. Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia Pengujian menggunakan bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5. Suspensi B. japonicum Bj11 (fase log, 100 µl dengan jumlah sel 10 7 per ml) diinokulasikan ke agar cawan dengan cara disebar. Media agar yang digunakan adalah media King s B yang mampu menumbuhkan B. japonicum Bj11 atau S. fredii Rif5 dan isolat Pseudomonas. Bulatan kertas saring steril (diameter 1 cm) dicelupkan ke suspensi isolat Pseudomonas (dari biakan 24 jam), kemudian diinokulasikan ke media agar cawan yang sudah diinokulasi B. japonicum Bj11 atau S. fredii Rif5. Media diinkubasi pada suhu 28 C selama 5 hari. Pengamatan dilakukan dengan mengamati zona hambatan oleh Pseudomonas. Sebaliknya, untuk mengetahui zona hambatan oleh rhizobia dilakukan dengan prosedur yang sama, tetapi B. japonicum Bj11 atau S. fredii Rif5 diinokulasikan ke media agar cawan yang terlebih dahulu diinokulasi dengan isolat Pseudomonas. Isolat Pseudomonas terbaik yang tidak antagonis terhadap B. japonicum Bj11 maupun S. fredii Rif5 dipilih untuk pengujian tanaman di rumah kaca.

43 20 Uji Pemacu Tumbuh di Rumah Kaca Pengujian dilakukan terhadap isolat terbaik, yakni Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang mampu memacu pertumbuhan kedelai di ruang penumbuh (growth room) dan kompatibel dengan rhizobia atau tidak bersifat antagonis terhadap B. japonicum Bj11 ataupun S. fredii Rif5. Prosedur pengujian pada tanah di rumah kaca mengikuti metode seperti yang diterapkan Cattelan et al. (1999). Contoh tanah percobaan diayak dengan ayakan 2 mm dan ditempatkan dalam pot plastik polietilen seberat 0,5 kg/pot (tanah steril) dan 2 kg/pot (tanah non-steril). Tanah dalam polibag plastik polietilen disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 0,1 Mpa, sebanyak 2 kali, masing-masing selama 1 jam dengan interval waktu 2 hari. Sterilisasi pot plastik polietilen dilakukan dengan cara sterilisasi permukaan plastik dengan alkohol 95%. Contoh tanah sebelum percobaan dianalisis untuk penetapan tekstur, ph, C-organik, N, P, K, dan kandungan kation dapat-tukar (basa-basa) di Balai Penelitian Tanah, Bogor. Hasil analisis tanah disajikan pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil analisis tanah dan kriteria Balai Penelitian Tanah (2005) tanah yang digunakan bertekstur lempung liat berdebu, ph masam (ph H 2 O 4,5), kandungan C-organik dan nitrogen tergolong rendah (C = 1,69% dan N = 0,13%), kandungan P tersedia sangat rendah (P 2 O 5 Bray 1 = 2,7 ppm), kandungan K terekstrak HCl 25% tergolong rendah (K 2 O HCl 25% = 11 mg/100 g tanah), kapasitas tukar kation (KTK) dan kejenuhan basa (KB) tergolong rendah (KTK = 13,67 cmol (+) /kg dan KB = 40%). Berdasarkan sifat tanah dan kriteria yang diuraikan di atas, maka tanah yang digunakan tergolong memiliki kesuburan rendah. Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL), masing-masing perlakuan diulang 5 kali. Sebagai perlakuan adalah kedelai yang diinokulasi dengan masing-masing 8 isolat Pseudomonas terpilih dan kedelai tanpa inokulasi sebagai kontrol. Penempatan pot di rumah kaca disajikan pada Gambar 6. Biji kedelai steril diinokulasi dengan masing-masing isolat dan kemudian dikecambahkan selama 2 hari seperti prosedur yang sudah diuraikan di atas. Dua kecambah kedelai dari masing-masing perlakuan ditanam pada masing-masing pot. Untuk menghindari kontaminasi dari udara, permukaan tanah dilapisi pasir steril

44 21 setebal 1 cm. Kadar air tanah pada pot diatur dengan penyiraman harian untuk mendapatkan potensial air tanah (soil water potential) yang setara dengan -0,03 MPa. Penjarangan dilakukan setelah tanaman muncul ke permukaan dan hanya satu tanaman yang dipelihara per pot. Tanaman ditumbuhkan selama 14 hari. 1 Crb17 K Crb24 Crb56 Crb12 Crb46 Crb47 Crb5 Crb49 2 Crb12 Crb17 Crb47 K Crb56 Crb24 Crb46 Crb49 Crb5 3 Crb56 Crb24 Crb17 K Crb49 Crb47 Crb46 Crb12 Crb5 4 Crb56 Crb46 K Crb5 Crb24 Crb47 Crb17 Crb49 Crb12 5 Crb47 Crb24 Crb49 Crb56 K Crb12 Crb5 Crb17 Crb46 Gambar 6. Skema penempatan pot secara acak dalam uji pemacu tumbuh pada media tanah steril dan tanah non-steril di rumah kaca (K = kontrol tanpa inokulasi; Crb17 adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas Crb17; angka 1 sampai 5 adalah nomor ulangan). Parameter pemacu tumbuh yang diukur meliputi tinggi tanaman dan bobot basah tajuk dan akar. Perbedaan hasil antar perlakuan dianalisis dengan analisis sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji beda nyata bertingkat DMRT (Duncan multiple range test) antar perlakuan menggunakan perangkat lunak SAS system for Windows v6.12. Uji Penekanan Penyakit Pengujian dilakukan terhadap tiga cendawan patogen, F. oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani. Sebelum digunakan untuk pengujian isolat, kemampuan cendawan patogen dalam menghambat perkembangan akar dan pertumbuhan kedelai diverifikasi dengan mengujinya menggunakan media agar semi-padat seperti tampak pada Gambar 7. Hasil pengujian menunjukkan bahwa ketiga cendawan patogen tersebut menghambat pertumbuhan kedelai.

45 22 Gambar 7. Hambatan pertumbuhan tanaman kedelai pada media agar semi-padat yang diinfestasi dengan cendawan patogen F. oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani. Pengujian penekanan penyakit dilakukan pada media tanah steril dan nonsteril di rumah kaca mengikuti prosedur Wang et al. (2000) dan Cattelan et al. (1999). Pengujian pada media tanah steril menggunakan campuran 400 g tanah dan 100 g pasir kuarsa yang disterilisasi 2 kali dengan autoklaf, masing-masing selama 1 jam dengan interval waktu 2 hari. Sterilisasi pot plastik polietilen dilakukan dengan cara sterilisasi permukaan plastik dengan alkohol 95%. Masing-masing cendawan patogen disiapkan dengan menumbuhkan satu potong cendawan patogen pada media padat potato dextrose agar (PDA) pada cawan Petri. Setelah 4 hari, beberapa potongan agar yang ditumbuhi patogen diperbanyak dengan menumbuhkannya dalam 500 ml media cair potato dextrose broth (PDB) selama 4 hari pada mesin pengocok dengan kecepatan 125 rpm. Cendawan diperbanyak dengan cara menginokulasikan 500 ml biakan patogen ke media PDB dalam galon berisi 3 sampai 5 L media PDB. Setelah diinkubasi selama 4 hari pada mesin pengocok, cendawan patogen dipisahkan dengan alat blender secara aseptik dan selanjutnya disuspensikan dalam akuades steril. Tanah pada pot diinfestasi dengan suspensi patogen, masing-masing dengan kepadatan 8,11 x 10 4 propagul F. oxysporum; 1,2 x 10 3 propagul S. rolfsii; dan 1,0 x 10 3

46 23 propagul R. solani per gram tanah. Kepadatan populasi biakan cendawan yang digunakan dihitung berdasarkan kurva standar yang ditetapkan dengan teknik pengenceran bertingkat dan pencawanan. Tingkat kepadatan populasi cendawan patogen per gram tanah mengikuti tingkat kepadatan cendawan yang digunakan Cattelan et al. (1999), yaitu minimal 10 3 propagul per gram tanah. Pada pengujian dengan tanah steril, tanah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas. Inokulasi ini dilakukan satu hari setelah infestasi cendawan patogen ke tanah. Isolat Pseudomonas diperbanyak dalam media kaya M26 seperti prosedur yang diuraikan di atas. Kepadatan isolat Pseudomonas yang diinokulasikan ke tanah adalah sebanyak 10 7 cfu per g tanah mengikuti prosedur Wang et al. (2000). Kecambah kedelai dari hasil inokulasi biji (seperti diuraikan di atas) ditanam pada pot sesuai masing-masing perlakuan, masing-masing 4 tanaman tiap pot. Penempatan pot percobaan mengikuti rancangan acak kelompok (RAK). Jumlah perlakuan adalah 10 perlakuan, yaitu 8 perlakuan adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas terpilih, 1 perlakuan dimana kedelai tidak diinokulasi dengan isolat tetapi tanah pada pot diinfestasi dengan cendawan patogen (kontrol positif), dan 1 perlakuan kedelai tidak diinokulasi dengan isolat serta tanah juga tidak diinfestasi dengan cendawan patogen (kontrol negatif). Tiap perlakuan diulang 3 kali (3 kelompok), tiap ulangan terdiri atas 4 pot, dan tiap pot terdiri atas 4 tanaman (Gambar 8). Kadar air tanah pada pot diatur dengan penyiraman harian untuk mendapatkan potensial air tanah (soil water potential) yang setara dengan -0,01 MPa (tanah lebih lembab). Prosedur pengujian pada tanah non-steril hampir sama dengan prosedur pengujian pada tanah steril seperti diuraikan di atas. Tanah yang digunakan adalah 2 kg per pot. Tanah hanya diinfestasi dengan cendawan patogen mengikuti prosedur Cattelan et al. (1999), sedangkan inokulasi dengan suspensi sel isolat Pseudomonas seperti pada percobaan dengan tanah steril di atas tidak dilakukan. Kecambah kedelai dari hasil inokulasi biji dengan masing-masing isolat ditanam pada pot, masing-masing 1 tanaman per pot. Pengujian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Jumlah perlakuan adalah 10 perlakuan seperti diuraikan di atas. Tiap perlakuan diulang 4 kali (Gambar 8).

47 24 Tanah Steril 0FS-1 FS46-1 FS24-1 SS17-1 SS56-1 0SS-1 RS5-1 1RS-1 RS47-1 FS17-1 FS12-1 FS5-1 SS46-1 SS12-1 SS49-1 RS49-1 0RS-1 RS12-1 FS47-1 FS56-1 FS49-1 SS24-1 SS47-1 SS5-1 RS24-1 RS56-1 RS46-1 1FS-1 1SS-1 RS17-1 FS5-2 FS47-2 FS17-2 SS49-2 1SS-2 SS56-2 1RS-2 0RS-2 RS24-2 FS24-2 FS56-2 1FS-2 SS5-2 SS17-2 SS46-2 RS17-2 RS49-2 RS47-2 FS46-2 FS49-2 0FS-2 SS12-2 0SS-2 SS47-2 RS12-2 RS56-2 RS46-2 FS12-2 SS24-2 RS5-2 FS49-3 0FS-3 FS46-3 SS49-3 SS17-3 SS56-3 0RS-3 RS56-3 1RS-3 FS5-3 FS17-3 FS12-3 SS47-3 SS5-3 SS46-3 RS17-3 RS47-3 RS24-3 FS56-3 FS47-3 1FS-3 1SS-3 SS12-3 0SS-3 RS46-3 RS12-3 RS49-3 FS24-3 SS24-3 RS5-3 (1) Fusarium oxysporum (2) Sclerotium rolfsii (3) Rhizoctonia solani Tanah Non-Steril FN56-3 FN56-2 0FN-3 FN17-3 SN46-3 SN24-4 SN47-3 1SN-1 RN47-2 RN46-1 RN47-3 RN12-1 FN17-4 FN12-4 FN17-2 FN24-1 SN24-2 SN49-2 SN56-1 SN17-3 RN49-1 RN5-3 RN56-2 RN56-3 1FN-4 FN47-2 FN49-4 FN49-1 1SN-4 SN12-2 SN5-1 0SN-4 RN12-2 RN47-1 0RN-3 RN12-4 FN12-1 FN24-2 FN47-3 FN56-1 SN49-4 SN49-1 SN12-3 SN46-1 RN24-4 RN17-4 RN24-3 RN17-2 1FN-3 FN12-3 FN17-1 FN5-2 SN17-1 SN17-4 SN49-3 SN24-3 RN46-2 RN24-1 RN12-3 RN56-1 FN46-1 0FN-2 FN12-2 FN56-4 SN12-4 SN47-1 SN47-2 SN47-4 RN49-4 RN24-2 0RN-4 RN17-3 FN5-1 FN47-4 1FN-2 FN24-3 0SN-1 SN5-4 SN24-1 SN5-2 0RN-1 1RN-3 0RN-2 RN46-4 FN46-3 FN5-4 FN24-4 FN49-2 SN56-3 SN46-4 SN5-3 SN56-4 RN49-3 RN17-1 RN49-2 RN5-4 FN5-3 FN46-2 0FN-1 FN47-1 SN56-2 SN12-1 0SN-3 SN46-2 RN46-3 1RN-4 RN56-4 RN47-4 1FN-1 FN49-3 FN46-4 0FN-4 SN17-2 1SN-3 1SN-2 0SN-2 1RN-2 RN5-1 1RN-1 RN5-2 (1) Fusarium oxysporum (2) Sclerotium rolfsii (3) Rhizoctonia solani Gambar 8. Skema penempatan pot pada pengujian ketahanan tanaman kedelai yang inokulasi dengan Pseudomonas penghasil ACC deaminase terhadap cendawan patogen pada tanah steril (atas) dan non-steril (bawah) di rumah kaca. (FS46-1 = tanah steril yang diinfestasi dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas Crb46 pada ulangan 1; FN56-3 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas Crb56 pada ulangan 3, dan seterusnya).

48 25 Tanaman ditumbuhkan selama 14 hari. Parameter yang diukur meliputi jumlah tanaman yang hidup (% hidup) dan bobot basah tajuk dan akar. Perbedaan hasil dari masing-masing perlakuan dianalisis dengan analisis sidik ragam (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji beda nyata bertingkat DMRT antar perlakuan dengan perangkat lunak SAS system for Windows v6.12.

49 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Penapisan Pseudomonas Pemacu Tumbuh Tanaman Kedelai Hasil pengujian terhadap 81 isolat Pseudomonas penghasil asam indol asetat (IAA) pada media steril kantong tumbuh disajikan pada Gambar 9 sampai dengan 14. Data hasil analisis varian disajikan pada Lampiran 2. Dari 81 isolat yang diuji, 13 isolat secara nyata meningkatkan panjang akar atau bobot akar atau keduanya, yaitu pada percobaan A, B, C, dan D (Gambar 9 sampai 12). Peningkatan panjang dan bobot akar ini mencapai 50% lebih tinggi daripada perlakuan kontrol (tanpa inokulasi). Ketigabelas isolat tersebut adalah Pseudomonas Crb46 dan Crb49 (Gambar 9); Crb26, Crb47, dan Crb56 (Gambar 10); Crb17, Crb31, dan Crb86 (Gambar 11); Crb5, Crb12, Crb24, Crb53, dan Crb94 (Gambar 12). Pada percobaan E dan F (Gambar 13 dan 14), isolat tidak nyata meningkatkan panjang atau bobot akar dibanding perlakuan kontrol. Pada percobaan F (Gambar 14), sebagian besar isolat yang digunakan cenderung menghambat perkembangan akar kedelai. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini memperlihatkan bahwa tidak terdapat hubungan antara kemampuan isolat menghasilkan IAA dengan kemampuan isolat meningkatkan panjang ataupun bobot akar kedelai. Ketigabelas isolat terbaik yang diperoleh ternyata memiliki kemampuan yang bervariasi dalam mensintesis IAA, yaitu dari 1,13 µg IAA ml -1 (Crb91) sampai 18,47 µg IAA ml -1 (Crb56). Isolat Pseudomonas Crb38 yang bukan penghasil IAA dan selalu disertakan dalam tiap set percobaan juga tidak nyata meningkatkan panjang atau bobot akar. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat Pseudomonas yang memiliki kemampuan mensintesis IAA dari triptofan atau senyawa dari eksudat akar kedelai (Whipps 1990; Frankenberger & Arshad 1991) belum menjamin keberhasilannya dalam memacu pertumbuhan tanaman kedelai. Berbagai hasil studi menyatakan bahwa IAA dalam konsentrasi rendah (0,005 µg ml -1 ) meningkatkan pertumbuhan tanaman (Tien et al. 1979; Arshad & Frankenberger 1993) dan pada konsentrasi tinggi menghambat pertumbuhan tanaman (Beyeler et al. 1997; Husen & Saraswati 2005). Hasil ini mengindikasikan bahwa kemampuan isolat meningkatkan pertumbuhan tidak hanya ditentukan oleh kemampuannya mensintesis IAA.

50 Crb38 Crb3 Crb15 Crb16 Crb21 Crb26 Crb27 Crb28 Crb32 Crb34 Crb35 Crb40 Crb41 Crb47 Crb48 Crb56 Selisih terhadap kontrol (%) Crb38 Crb1 Crb18 Crb19 Crb25 Crb29 Crb33 Crb42 Crb44 Crb46 Crb49 Crb60 Crb74 Selisih terhadap kontrol (%) A * * * Panjang akar Bobot akar Gambar 9. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan A. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol B * * * Panjang akar Bobot akar Gambar 10. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan B. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol.

51 Crb38 Crb5 Crb8 Crb12 Crb24 Crb36 Crb39 Crb53 Crb75 Crb78 Crb83 Crb87 Crb94 Crb110 Crb114 Selisih terhadap kontrol (%) Crb38 Crb2 Crb6 Crb13 Crb17 Crb22 Crb23 Crb31 Crb43 Crb79 Crb80 Crb81 Crb85 Crb86 Crb115 Selisih terhadap kontrol (%) C * * * Panjang akar Bobot akar Gambar 11. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan C. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol D ** * ** * * Panjang akar Bobot akar Gambar 12. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan D. Tanda * = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol.

52 Crb9 Selisih terhadap kontrol (%) Crb20 Crb52 Crb54 Crb11 Crb30 Crb89 Crb95 Crb37 Crb45 Crb50 Crb111 Crb38 Crb14 Selisih terhadap kontrol (%) Crb38 Crb4 Crb10 Crb51 Crb55 Crb82 Crb84 Crb92 Crb93 Crb102 Crb104 Crb109 Crb112 Crb E Panjang akar Bobot akar Gambar 13. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan atau pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan panjang maupun bobot akar F Panjang akar Bobot akar Gambar 14. Pengaruh isolat Pseudomonas (Crb) terhadap pertambahan atau pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan panjang maupun bobot akar dan isolat cenderung menghambat panjang dan bobot akar.

53 31 Aktivitas ACC Deaminase Hasil pengujian aktivitas ACC deaminase terhadap 13 isolat yang mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai di ruang penumbuh disajikan pada Tabel 3 dan Gambar 15. Dari 13 isolat Pseudomonas tersebut, 11 isolat memiliki aktivitas ACC deaminase. Hasil ini ditunjukkan oleh kemampuan isolat tersebut tumbuh dalam media garam minimal Dworkin-Foster (DF) baik yang diperkaya dengan amonium sulfat maupun dengan ACC sebagai sumber nitrogen (Gambar 15). Aktivitas ACC deaminase juga ditunjukkan oleh nilai kerapatan optik (600 nm) 0,05 atau lebih dalam media DF yang diperkaya ACC yang mengindikasikan bahwa isolat mampu mendegradasi substrat ACC sebagai satu-satunya sumber N. Pada media garam minimal DF tanpa sumber N tidak ada isolat yang mampu tumbuh yang mengindikasikan bahwa isolat tidak tergolong bakteri diazotrof yang dapat menambat N 2 udara. Gambar 15. Pertumbuhan isolat Pseudomonas pada cawan-agar media M26 (A), DF + amonium sulfat (B), dan DF + ACC (C).

54 32 Tabel 3. Aktivitas ACC deaminase pada media garam minimal Dworkin-Foster (DF) ditambah amonium sulfat dan ACC sebagai sumber N. No. Pseudomonas IAA (µg ml -1 )* DF+ACC cair (OD 600 ) a Aktivitas ACC deaminase DF+ACC agar b DF+AmS agar b 1 Crb5 12,75 0, Crb12 6,68 0,057 +/- + 3 Crb17 16,02 0, Crb24 15,16 0, Crb26 12,53 0,061 +/- + 6 Crb31 5,45 0, Crb46 15,80 0, Crb47 10,36 0, Crb49 16,19 0,096 +/ Crb53 16,90 0, Crb56 18,47 0, Crb86 6,31 0, Crb94 1,13 0,051 +/ Crb38 0,0 0,111 +/- + Keterangan: * = Data hasil penelitian Wahyudi et al. (2007) a Berdasarkan nilai kerapatan optik pertumbuhan isolat dalam media cair garam minimal DF + ACC pada 600 nm menggunakan UV spectrophotometer. Kerapatan optik > 0,05 mengindikasikan aktivitas ACC deaminase (Wang et al. 2000). b Berdasarkan kemampuan isolat tumbuh pada media padat garam minimal DF + ACC sebagai sumber nitrogen. Tanda + = koloni tumbuh jelas pada cawan agar setelah 48 jam; tanda +/- = koloni tumbuh jelas setelah 96 jam; dan tanda - = koloni tidak tumbuh.

55 33 Data pada Tabel 3 memperlihatkan bahwa 2 dari 13 isolat terpilih, yaitu Pseudomonas Crb31 dan Crb86, tidak memiliki aktivitas ACC deaminase. Namun kedua isolat ini mampu meningkatkan panjang atau bobot akar kedelai. Kemampuan kedua isolat ini memproduksi IAA relatif rendah dibanding isolat lainnya, yaitu masing-masing 5,45 dan 6,31 µg ml -1 (Tabel 3). Hasil ini mengindikasikan bahwa IAA yang dihasilkan oleh kedua isolat ini diduga tidak cukup tinggi untuk memicu biosintesis hormon etilen yang dapat menghambat perkembangan akar. Pada bagian lain, Pseudomonas Crb38 yang memiliki aktivitas ACC deaminase, namun bukan penghasil IAA, juga tidak mampu meningkatkan panjang dan bobot akar. Hasil ini mengindikasikan bahwa terdapat peran fisiologis ACC deaminase dalam mengoptimalkan fungsi IAA dalam memacu pertumbuhan kedelai seperti diuraikan oleh Glick at al. (2007). Hasil penelitian tentang keterkaitan hormon IAA dengan etilen dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman sudah banyak dihasilkan dan dibahas. Hormon IAA merangsang proliferasi dan pemanjangan sel tanaman. Namun, IAA juga memicu terbentuknya enzim ACC sintase yang mengubah senyawa S- adenosylmethionine (AdoMet) menjadi ACC yang selanjutnya dioksidasi menjadi etilen oleh ACC oksidase (Kende 1993). Sebagai hormon senesen, etilen berperan penting dalam mempercepat proses pembungaan dan pematangan buah. Namun, peningkatan konsentrasi etilen pada awal pertumbuhan vegetatif justru menghambat perkembangan akar (Glick 1995; Mayak et al. 1997; Shah et al. 1997). Dengan adanya bakteri penghasil ACC deaminase di lingkungan rizosfer, ACC yang diproduksi dan dikeluarkan akar atau biji tanaman, mengikuti proses kesetimbangan antara ACC di dalam dan di luar jaringan tanaman seperti diuraikan oleh Glick et al. (1998), akan didegradasi oleh bakteri. Degradasi ACC secara terus menerus oleh bakteri penghasil ACC deaminase akan menurunkan sintesis hormon etilen dalam jaringan akar, sehingga peran hormon IAA dalam meningkatkan perkembangan akar tidak terganggu. Hasil penelitian Mayak et al. (1997) membuktikan bahwa tingginya konsentrasi etilen dalam jaringan akar dapat disebabkan oleh: (i) IAA diproduksi secara berlebihan oleh bakteri maupun tanaman, sehingga konsentrasi ACC (prekursor etilen) dan selanjutnya etilen meningkat, atau (ii) tidak terdapat bakteri

56 34 penghasil ACC deaminase dalam lingkungan akar yang mampu mendegradsai ACC, sehingga konsentrasi ACC dan etilen meningkat. Dari hasil uji in planta dan uji aktivitas ACC deaminase secara in vitro seperti diuraikan di atas diperoleh 11 isolat Pseudomonas penghasil IAA yang mampu menghasilkan ACC deaminase dan meningkatkan panjang dan bobot akar kedelai. Kesebelas isolat tersebut adalah Pseudomonas Crb5, Crb12, Crb17, Crb24, Crb26, Crb46, Crb47, Crb49, Crb53, Crb56, dan Crb94 yang selanjutnya diuji kompatibilitasnya dengan bakteri bintil akar rhizobia. Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia Hasil pengujian kompatibilitas isolat Pseudomonas dengan 2 isolat rhizobia lokal Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5 disajikan pada Tabel 4 dan Gambar 16. Dari 11 isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase, 3 isolat bersifat antagonis terhadap salah satu atau kedua bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan S. fredii Rif5. Isolat Pseudomonas Crb26 menghambat perkembangan B. japonicum Bj11, isolat Crb53 agak menghambat perkembangan S. fredii Rif5, dan isolat Crb94 menghambat perkembangan kedua bakteri bintil akar (Tabel 4). Reaksi penghambatan isolat Pseudomonas yang menjadi indikasi aktivitas anti rhizobia (sifat antagonis) ditunjukkan oleh zona terang di sekeliling koloni isolat Pseudomonas yang ditumbuhkan bersama dengan rhizobia pada cawan agar King s B (Gambar 16). Berdasarkan reaksi penghambatan tersebut, maka 3 isolat penghasil ACC deaminase, yaitu Pseudomonas Crb26, Crb53, dan Crb94 tidak potensial digunakan sebagai inokulan tanaman kedelai. Delapan isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar adalah Pseudomonas Crb5, Crb12, Crb17, Crb24, Crb46, Crb47, Crb49, dan Crb56. Kedelapan isolat ini diuji kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan dan daya tahan tanaman kedelai terhadap patogen cendawan akar Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani.

57 35 Tabel 4. Reaksi penghambatan (antagonis) isolat Pseudomonas terhadap bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5 pada media cawan agar King s B. No. Pseudomonas Aktivitas penghambatan B. japonicum Bj11 S. fredii Rif5 1 Crb Crb Crb Crb Crb Crb Crb Crb Crb53 - +/- 10 Crb Crb Keterangan: +/- = agak menghambat; + = menghambat pertumbuhan rhizobia Gambar 16. Uji kompatibilitas Pseudomonas dengan rhizobia pada agar cawan King S B, yaitu reaksi antagonis B. japonicum Bj11 terhadap Pseudomonas Crb26 (A) yang ditunjukkan oleh zona penghambatan warna terang di sekeliling koloni isolat (bulatan kertas saring) dan reaksi tidak antagonis S. fredii Rif5 terhadap Pseudomonas Crb56 (B).