SENYAWA FITOALEKSIN DARI TUMBUHAN OBAT INDONESIA DEKAR, Caesalpinia major (FABACEAE)

Transkripsi

1 SENYAWA FITALEKSIN DARI TUMBUAN BAT INDNESIA DEKAR, Caesalpinia major (FABACEAE) Partomuan Simanjuntak Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jakarta Abstract Some furan diterpene type compounds have been isolated and elucidated as caesaldekarin a, b, c, d, e and f from Caesalpinia major. Recently, a phytoalexin compound, 12-oxy-7-oxosandaracopymaradiene has been isolated and identified from the same plant. The structure was elucidated based on interpretation by infrared, nuclear magnetic resonance ( 1 -NMR, 13 C-NMR) and two-dimensional NMR ( 1-1 CSY and 13 C- 1 CSY) and mass spectroscopy. Key words: Indonesian medicinal plant; Phytoalexin; 12-oxy-7-oxosandaracopy- maradiene; Caesalpinia major; Fabaceae PENDAULUAN Fitoaleksin Phytoalexin didefinisikan sebagai senyawa kimia yang mempunyai berat molekul rendah yang memiliki sifat antimikroba atau antiparasit. Senyawa ini diproduksi oleh tanaman pada waktu mengalami infeksi atau cengkraman (stress) lingkungan. Senyawa fitoaleksin seperti orizaleksin A, B, dan C telah berhasil diisolasi dan dielusidasi struktur kimianya dari daun Pyricularia oryzae yang terinfeksi (2,6). Substansi fitoaleksin lainnya dari tumbuhan P. oryzae yang pernah diteliti adalah momilakton A dan B. Senyawa kimia ini dapat terjadi sebagai fitoaleksin dalam coleoptile beras yang teriradiasi oleh ultra-violet (1). Fitoaleksin yang merupakan hasil dari metabolisme sekunder, mempunyai struktur kimia yang bermacam-macam tergantung pada species tanaman yang mensintesisnya. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaporkan, senyawa fitoaleksin dapat diidentifikasi menurut penggolongan senyawanya, misalnya Leguminosae membentuk fitoaleksin yang berupa golongan senyawa isoflavonoid, famili terong-terongan menghasilkan senyawa seskuiterpen, sedangkan dari famili Compositae membentuk poliasetilen dan lain-lain. Dari tumbuhan famili Fabaceae yaitu tanaman Caesalpinia major, yang dalam tulisan ini akan dilaporkan bahwa senyawa fitoaleksin yang terisolasi dan teridentifikasi adalah merupakan senyawa golongan diterpen. Caesalpinia major Dandy ex Excel (Fabaceae) adalah suatu tumbuhan memanjat yang banyak terdapat di hutan dan di pinggir-pinggir sungai. Tumbuhan ini di Ruteng, Pulau Flores, Nusa Tenggara Timur secara tradisional digunakan sebagai obat kuat (tonikum), antelmentik dan juga untuk menyembuhkan sakit pinggang (3). Dari penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa dari tumbuhan Dekar (nama daerah), Caesalpinia major telah berhasil diisolasi dan dielusidasi enam senyawa kimia diterpen tipe kasan yaitu caesaldekarin a (1), b (2), c (3), d (4), e (5) dan caesaldekarin f (6) (4,5,7). Dalam tulisan ini akan dilaporkan bahwa selain senyawa kimia tersebut di atas, juga mengandung suatu senyawa kimia fitoaleksin yang dinamakan sebagai 12-oksi-7-oksosandarakopimaradiena (7). asil reaksi pengubahan conversion reaction senyawa 7 dalam bentuk reaksi asetilasi dan reaksi hidrogenasi juga akan dilaporkan. BAAN DAN METDE Bahan. Simplisia akar Dekar, Caesalpinia major dalam penelitian ini dikumpulkan dari Desa Ruteng, Pulau Flores, Nusa Tenggara Timur. Determinasi dilakukan di erbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi- LIPI Bogor dan spesimennya disimpan di erbarium tersebut. Pelarut-pelarut kimia seperti metanol, n- heksan, etil asetat adalah kualitas teknis yang digunakan hanya untuk pelarut dalam mengekstraksi, pelarut pengembang (eluen) pada kromatografi lapis tipis (KLT) dan untuk kromatografi kolom, sedangkan untuk kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) digunakan pelarut kualitas PLC grade (Lichrosolv). Bahan kimia seperti dimetilaminopiridin (DMAP) yang digunakan sebagai katalisator dalam reaksi esterifikasi, asam asetat anhidrid yang digunakan untuk reaksi asetilasi, dan natrium boronhidrida (NaB 4 ) yang digunakan sebagai reduktor dalam reaksi hidrogenasi yang semuanya merupakan bahan kimia produksi dari Sigma Co. 58

2 Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN Vol. 1, No. 2, Juli 2002 Instrumentasi. Data-data spektra dalam elusidasi struktur kimia diperoleh dengan menggunakan spektrometer itachi 330 untuk pengambilan data spektra ultra violet, spektrometer JASC FT/IR untuk pengambilan data spektra infra merah, spektrometer JMS X-100 untuk pengambilan data spektra massa (FAB-MS), Spektrometer NMR JEL EX-270, dan NMR GX-500 untuk pengambilan data spektra satu dimensi resonansi magnet inti (RMI proton dan 13 Karbon), dan dua dimensi seperti 1-1 CSY, 13 C- 1 CSY. Pemurnian senyawa kimia dilakukan pada alat PLC itachi L-4200 UV/VIS Detektor dengan pompa Shimadzu LC-6A, dan kolom Zorbax Sil (7,5 x 30 mm). R 3 CC Caesaldekarin a, R=Ac (1) Caesaldekarin c (3) Caesaldekarin d (4) Caesaldekarin b, R= (2) Ac Ac Caesaldekarin e (5) Caesaldekarin f (6) 12-oksi-7-okso-sandara kopimaradiena (7) Gambar 1. Senyawa Kimia asil Isolasi Dari Tumbuhan Dekar, Caesalpinia major (Fabaceae) Isolasi. Simplisia akar Dekar, Caesalpinia major yang telah dikeringkan pada sinar matahari, dipotong kecil-kecil sebanyak 2,5 kg dan diekstraksi dengan metanol panas sebanyak tiga kali hingga Uji KLT tidak memberikan spot atau noda. asil ekstraksi disaring dan diuapkan dengan penguap berputar bertekanan rendah hingga diperoleh ekstrak methanol sebanyak 250 g (10%, persentase dihitung dari 1 kg berat kering simplisia). Sebanyak 150 gram ekstrak methanol dipartisikan ke dalam campuran air dan etil asetat = 1 : 1. Lapisan organik etil asetat diuapkan dan ditimbang sehingga diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 15 g (1%). Fraksinasi ekstrak etil asetat sebanyak 50 gram dengan melakukan kromatografi kolom dengan menggunakan adsorben silika gel (4 kg), sistem pelarut n-heksan-etil asetat = 100 : 1 1 : 1 memberikan senyawa Caesaldekarin a (1) (6,43 g, 0,64%) dari fraksi I, sedangkan hasil pemurnian fraksi II memberikan senyawa Caesaldekarin b (2) sebanyak 373 mg (0,04%), Caesaldekarin c (3) sebanyak 59 mg, 1,006%, Caesaldekarin d (4), 12 mg, 0,001%, Caesaldekarin e (5) 63 mg, 0,006% dan Caesaldekarin f (6) sebanyak 193 mg (0,02%) (4,5). Fraksi III sebanyak 156 dilakukan pemurnian dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT, Zorbax Sil, sistem pelarut n-heksan -etil asetat = 5 : 1) diperoleh senyawa 7 sebanyak 90 mg (0,009%). Prosedur isolasi dan pemurnian senyawa kimia dari tumbuhan Dekar, Caesalpinia major, dapat dilihat pada Gambar 2. Asetilasi Senyawa 7 Sebanyak 17,1 mg senyawa 7 ditambahkan dengan 0.5 ml piridin, 5 tetes asetat anhidrid dan 10 tetes Dimetilaminopiridin (DMAP). Reaksi dilakukan pada suhu 0 C selama 30 menit dengan dimonitor 59

3 oleh uji kromatografi lapis tipis (KLT). Pada hasil reaksi ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil asetat serta diasamkan dengan asam klorida encer, kemudian dinetralkan dengan natrium hidroksida. Lapisan organik yang berisi senyawa campuran, dipisahkan dan dimurnikan dengan kromatografi kolom (Si 2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil asetat = 8 : 1) dan diperoleh senyawa turunan ester asetat (senyawa 8) sebanyak 5,7 mg. idrogenasi senyawa 7 Sebanyak 10,3 mg senyawa 7 ditambahkan 0,5 ml metanol dan 1 mikro spatula penuh Natrium boronhidrida (NaB 4 ). Reaksi dilakukan pada suhu kamar selama 20 menit. Pada hasil reaksi ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil asetat. Lapisan organik (etil asetat) diuapkan pada penguap berputar, kemudian dimurnikan dengan kromatografi kolom (Si 2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil asetat = 4 : 1) dan diperoleh senyawa 9 sebanyak 8,9 mg. *) Dihitung dari 1 kg berat kering Akar Dekar (Caesalpinia major) (2,5 kg) Diekstraksi dengan Me 3x, disaring, diuapkan Ekstrak Me (250 g, 10%)* Diambil 150 g) Dipartisi dalam Etil asetat-air = 1 : 1 Ekstrak EtAc (100 g, 6,6%) Ekstrak Air Kr. Kolom (Si 2, n-heksan-etac = 100 : 1 ~ 1 : 1) Caesaldekarin a (1) (6,43 g, 0,64%) Fr. II Caesaldekarin b (2), 373 mg, 0,04% Caesaldekarin c (3), 59 mg, 0,006% Caesaldekarin d (4), 12 mg, 0,001% Caesaldekarin e (5), 63 mg, 0,006% Caesaldekarin f (6), 193 mg, 0,02% Fr. III (156 mg) Fr. VIII KCKT (Zorbax Sil, n- heksan-etac= 5 : 1) 12-oksi-7-oksosandarakopimaradiena (7) (90 mg, 0,009%) Gambar 2. Isolasi Senyawa Fitoaleksin (12-oksi-7-okso Sandarakopimaradiena) dari Dekar, Caesalpinia major ASIL DAN PEMBAASAN Senyawa 7 yang diperoleh pada hasil pemurnian KCKT direkristalisasi dengan pelarut n- heksan dan eter. Kristal yang berbentuk padatan dan tidak berwarna colorless needless ini mempunyai titik lebur (TL) C, [α] D + 19,7 (c = 0,34 dalam kloroform). Spektrometri ultra-violet (UV) untuk senyawa 7 tidak menunjukkan adanya serapan maksimum di atas 200 nm, Pemeriksaan spectra dari spektrometri infra-merah (IM) menunjukkan bilangan gelombang pada 3500 dan cm -1 yang membuktikan adanya gugus karbonil dan hidroksil pada struktur tersebut. Rumus molekul yang diperoleh berdasarkan spektrometri massa resolusi tinggi (R-MS) ditetapkan sebagai C dengan berat molekul berdasarkan perhitungan ( calculated ) sebesar 302,2243 dan berdasarkan penemuan ( found ) sebesar 302,2225 (M + ). Penyidikan spektra resonansi magnet inti (RMI) proton (500 Mz, CDCl 3 ) untuk senyawa 7 menunjukkan adanya sinyal pada δ 3,95 (1, d, J=5,0 z, -12) yang karakteristik untuk proton yang

4 Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN Vol. 1, No. 2, Juli 2002 visinal dengan gugus hidroksil. Adanya ikatan rangkap dua pada posisi atom C-14, C-15 dan C-16 ditunjukkan pada δ 5,31 (1, s, 14-); 5,75 (1, dd, J= 11,0; 18,0 z, -15) dan 4,91 (2, dd, J =11,0; 18,0 z, -16a, -16b). Dari spektrum RMI 13 Karbon (125 Mz, CDCl 3 ) dan analisa DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) menunjukkan bahwa semua atom karbon yang terdapat pada struktur kimia tersebut terdiri dari dua puluh sinyal. Lima sinyal berada pada daerah medan rendah ( Low field ) yang karakteristik untuk karbon-karbon dari ikatan rangkap dua dan karbonil yaitu pada δc 153,3 (s, C-8) ; 130,2 (d, C-14); 148,3 (d, C-15); 110,6 (t, C-16) dan 210,7 (s, C-7, gugus karbonil). Karbon teroksigenasi pada δc 82,6 (d) adalah menunjukkan adanya gugus hidroksil yang berada pada atom C-12 dengan dibuktikan adanya korelasi proton-proton antara -12 dan -11 pada spektrum dua dimensi RMI ( 1-1 CSY). Keberadaan gugus hidroksil pada C-12 dibuktikan dengan melakukan reaksi asetilasi pada senyawa 7 yang menghasilkan senyawa turunan ester asetat (senyawa 8). Penyidikan spektra RMI proton senyawa 8 menunjukkan adanya muncul gugus asetoksi pada δ 2,19 (s) dan 4,99 (s, melebar, -12) (Lihat Tabel 1). Tabel 1. Pergeseran Kimia Senyawa 7 (Karbon dan Proton), Senyawa 8, 9 (Proton), (J dalam ertz) No Senyawa 3 Senyawa 4 Senyawa 5 Karbon Proton Proton proton 1 51,3 1,42 (m) 1,27 (dd,broad) 1,26 (m) 2 18,9 2,34 (m) 2,14(ddd,J=5,0;8,5;13, 5 2,32 (m) 2,14 (m) 2,35 (m) 2,15 (m) 3 22,2 1,74 (m) 1,67 (m) 1,57 (m) 4 45, ,5 2,0 (t,j=9,0) 2,11 (d,broad) 2,00 (t,j=8) 6 34,2 1,54 (m) 1,57 (m) 1,55 (m) 7 210,7-4,14 (s, broad) 4,99 (s,broad) 8 153, , ,5 1,68 (dd,j=3,0;12,0) 1,64 (dd,j=3,0;12,0) 1,75 (d,j=11) 11 35,3 2,29 (dd,j=13,0;13,0) 2,52 (dd,j=13,0;13,0) 2,11 (dd,j=13;13) 2,30 (dd,j=13;13) 2,39 (d,j=12) 2,47 (d,j=12) 12 82,6 3,95 (d,j=5,0) 3,24 (s, broad) 4,91 (s) 13 37, ,2 5,31 (s) 5,27 (s) 5,33 (s) ,3 5,75 (dd,j=11,0;18,0) 5,77 (dd,j=11;18) 5,76 (dd,j=11;18) ,6 4,91 (dd,j=11,0;18,0) 4,91 (dd,j=11;18) 4,94 (dd,j=11;18) 17 16,6*) 0,70 (s)*) 1,03 (s)*) 0,83 (s)*) 18 15,4*) 080 (s)*) 1,04 (s)*) 0,88 (s)*) 19 26,2*) 1.04 (s)*) 1,05 (s)*) 1,05 (s)*) 20 29,3*) 1,19 (s)*) 1,06 (s)*) 1,12 (s)*) Ac - - 2,19 (s) *) : Mungkin saling bertukar Pengamatan sinyal pada daerah medan tinggi (high field) menunjukkan adanya empat sinyal yang ditetapkan sebagai gugus metil masing-masing pada δ 0,70 (s, -17); 0,80 (s, -18); 1,04 (s, -19) dan 1,19 (s, -20), dan RMI 13 Karbon ditunjukkan pada δc 16,6 (C-17); 15,4 (C-18); 26,2 (C-19) dan 29,3 (C-20) yang semuanya berbentuk kuartener. Dari analisis spektrum 2D-RMI 13 C- 1 CSY menunjukkan bahwa semua karbon memperlihatkan korelasi dengan protonnya. Kemudian pengamatan spektra 2D-RMI ( 1-1 CSY ) memberikan hubungan antara protonproton dari -1 dengan -2 dan -10; proton dari - 2 dengan -3; -5 dengan -6; -11 dengan -12, dan -15 dengan -16. Adanya gugus karbonil pada atom C-7 dibuktikan dengan tidak adanya korelasi antara -6 dengan -7. al ini juga dibuktikan dengan melakukan reaksi hidrogenasi senyawa 7 dengan Natrium boronhidrida (NaB 4 ) menjadi senyawa dihidroksil (9). Spektra RMI proton pada senyawa 9 menunjukkan adanya perubahan gugus karbonil menjadi gugus hidroksil yaitu munculnya sinyal baru pada δ 3,24 (s, melebar, -7) selain pada δ 4,14 (-12) (Lihat Tabel 1). Sehingga dari hasil analisis spektrum RMI (proton dan 13 Karbon) dan data kimia fisik lainnya untuk senyawa 7 dapat ditetapkan struktur kimianya sebagai senyawa fitoaleksin yaitu 12-oksi-7-okso-sandarakopimaradiena (1,2). Data pergeseran kimia proton dan karbon untuk senyawa 7, dan pergeseran kimia proton untuk senyawa 8 dan 9 dapat dilihat pada Tabel 1. 61

5 4,91 ppm Ac 2,19 ppm Asetat anh./py. (8) DMAP, o o C 4,14 ppm (7) NaB 4 Suhu kamar 3,24 ppm (9) Gambar 3. Transformasi Kimia Senyawa 7 Dengan Cara Asetilasi Dan idrogenasi KESIMPULAN 1. asil isolasi dan elusidasi struktur kimia pada tumbuhan obat tradisional Dekar, Caesalpinia major (Fabaceae) memberikan enam senyawa diterpen tipe kasan yaitu Caesaldekarin a, b, c, d, e, f dan satu senyawa diterpen tipe damaran yaitu dengan nama fitoaleksin yaitu 12-oksi- 7-oksosandarakopimaradiena. 2. Senyawa Fitoaleksin yang terbentuk pada tumbuhan Caesalpinia major ada kemungkinan pada saat pengumpulan material telah terinfeksi oleh mikroorganisme, dan pada saat melakukan isolasi dan ekstraksi bahan material tersebut belum kering sekali. Ucapan terima kasih Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Prof. I. Kitagawa dan Prof. M. Kobayashi di laboratorium Natural Product Chemistry, Fac. of Pharmaceutical Sciences, saka University, Japan dan juga kepada Prof.. Shibuya di Fukuyama University, Japan atas bantuan saran-saran dan pengambilan data-data spektra RMI (proton dan 13 Karbon). DAFTAR PUSTAKA 1. Akatsuka, T.,. Kodama,. Kato and S. Takeuchi, hydroxy-7-oxosandaracopimaradiene (ryzalexin A), A New phytoalexin isolated from rice blast leaves, Agric. Biol. Chem., 47, Akatsuka, T.,. Kodoma,. Sekido, Y. Kono and S. Takeuchi, 1985 Novel Phytoalexin (ryzalexins A, B and C) Isolated from rice blast leaves infected with Pyricularia oryzae, Agric. Biol. Chem., 49, Kitagawa, I., 1987 Research Report of Naturally ccuring Drug Materials in Indonesia I, saka University Press, saka, Japan, 127 p. 4. Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Watano,. Shibuya, S. Fujii, Y. Yamagata dan M. Kobayashi, 1994a Indonesian Medicinal Plants XI. Chemical Structures of Caesaldekarin a dan b, Two New Cassane-type Furanoditerpenoid from the roots of Caesalpinia major (Fabaceae), Chem. Pharm. Bull. 42, Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Mahmud, M. Kobayashi, S. Fujii, T. Uji and. Shibuya, 1994b Indonesian medicinal Plants XIII : Chemical Structures of Caesaldekarins c, d, and e, three Additional Cassane-Type Furanoditerpenes from The Roots of Caesalpinia major (Fabaceae). Chem. Pharm. Bull. 44, Kono, Y., S. Takeuchi,. Kodama, and T. Akatsuka 1984 Absolute configuration of ryzalexin A and structures of its related phytoalexins isolated from rice blast leaves infected with Pyricularia oryzae Agric. Biol. Chem., 48, Simanjuntak, P Senyawa Furanoditerpenoid dari Dekar, Caesalpinia major (Fabaceae). UNESC National Seminar on Chemistry of Natural Product of Indonesian Plants. Depok, Februari 1995,